本发明专利技术涉及了一种新的蛋白质定量方法-等重二甲基化标记定量法，该方法利用甲醛和氰基硼氢化钠及其各自的同位素形式进行有机组合，对肽段进行标记，使得肽段在质谱的一级谱上具有相近质荷比而在二级谱上具有不同质荷比，从而在二级谱上实现蛋白质定量分析。该方法相较于其他定量方法，该方法具有定量准确度高，精密度高和动态范围高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设计了一种等重标记定量法，可实现蛋白质样品大规模，高准确度和高精密度定量，此外该方法还有其他优点如可以同时实现高达六重标记，方法标记简单，标记效率高，无副反应，价格低等。该方法可以用于生物样品的蛋白质组学的定量分析。
技术介绍
定量蛋白质组学是系统生物学研究的热点内容，它为发现疾病生物标志物，发现蛋白质-蛋白质相互作用，药物-蛋白相互作用，解释疾病发生机理，解释生物学代谢过程等提供极为重要的数据支持。蛋白质是生命活动的体现者和承担者，在生物体内含量极为丰富，参与生命体所有代谢过程，因而蛋白质含量的变化会导致生理学的变化，而对于人类而言，则体现为疾病的发生，因而实现蛋白质的准确定量对于理解疾病发生的机理极为重要。 现有的定量方法主要是基于液相色谱质谱联用方法。现有的标记方法有代谢标记，化学标记，酶解标记等，这其中基于化学标记的稳定同位素标记方法使用尤为广泛，因为该方法适用于任何来源的蛋白质样品。基于一级谱的定量方法定量结果的精密度低于基于二级谱报告离子方法的定量结果，而基于二级谱报告离子的定量容易受到共洗脱组分的影响，定量准确度低于基于一级谱的结果。为此人们设计了基于碎片离子的定量方法，如 IPTL (J.Proteome Res.2009, 8, 4333 ；Anal.Chem.2011, 83, 4775), IVTAL (Anal.Chem.2011，83，6026)和 QITL(Journal of proteomics2012, 75，5797)等。IPTL 需要多步反应，标记效率和标记的选择性较差，而IVTAL则只适合细胞样品，QITL需要多步反应，样品损失大，标记效率较差，尤其是18O标记。
技术实现思路
为此，我们设计了新型标记方法，利用甲醛和氰基硼氢化钠及其同位素形式进行有机组合，实现了等重标记。 为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为: 1.细胞样品蛋白质提取过程:加入裂解液和蛋白酶抑制剂混合液悬浮细胞样品，用组织碎片器在10000的转速下破碎，然后超声破碎100s。蛋白质提取液用25000g离心后弃去沉淀，上清液用丙酮沉淀，再离心弃去上清后，蒸干，复溶后用Bradford法测定蛋白浓度。 2.提取的蛋白质经变性还原烷基化后，根据酶的种类按照一定的酶/蛋白的比例加入酶，孵育过夜。 3.13CH2O 与 NaCNBH3, CH2O 与 NaCNBD3,13CH2O 与 NaCNBD3, CD2O 与 NaCNBH3,13CD2O 与NaCNBH3和CD2O与NaCNBD3共六种组合标记试剂分别定义为Lu Lh, Ml, Mh, Hl, Hh,即三组标记试剂和U为一组(L组)，Ml和Mh —组(M组)，Hl和Hh为一组(H组)。 4.当选择L组、M组和H组的任意一组时，分别对两种样品进行标记，可实现蛋白质样品的两重标记。 5.当选择L组、M组和H组的任意两组时，分别对四种样品进行标记，可实现蛋白质样品的四重标记。 6.当选择L组、M组和H组的全部三组时，分别对六种样品进行标记，可实现蛋白质样品的四至六重标记。 7.轻重标记完的样品混合后，用C18SPE柱除盐，用冷冻蒸干仪将样品蒸干，复溶后，可以进行LC-MS的分析。 本专利技术具有如下优点: 1.样品预处理简单，该方法的样品预处理过程与常规的样品预处理过程相同。 2.标记方法简单、高效、快速而且反应效果高，该方法可以在一小时以内完成样品的标记，标记效果超过95%。 3.该标记方法标记样品成本低，100 μ g蛋白质样品标记价格低,低于iTRAQ, TMT等试剂的价格。 4.无同位素重叠效应,轻标记和重标记的碎片离子的质量差仅仅为5.84mDa,不存在同位素峰重叠。 5.多种碎片离子用于肽段定量，降低共洗脱组分的干扰，提高定量的准确度和精山/又ο 6.不存在因为氘原子的引入导致轻重标记肽段在反相色谱上的保留时间的迁移。 【附图说明】 图1等重二甲基化标记示意图。R为肽段中除氨基以外剩余的部分； 图2等重标记方法用于小鼠肺癌高低转移细胞株差异蛋白质分析结果分布图。 【具体实施方式】 1.蛋白质提取过程:首先将细胞用I XPBS清洗至没有血液。用2mL8M尿素加上终浓度为0.1% (v/v)的商品化蛋白酶抑制剂(protease inhibitor cocktail,购自sigma)作为裂解液分别悬浮约500mg小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系(Hca-F)和约500mg低转移细胞系(Hca-P)，用组织破碎器在10000转/分钟的转速下将细胞株破碎。然后超声破碎100s。超声后的蛋白质提取液在25000g离心力下离心30min后,用_80°C的丙酮沉淀，离心弃去上清后，蒸干，用ImLSM尿素复溶，后用Bradford法测定蛋白浓度。-20°C保存待用。 2.蛋白质样品处理过程:100μ Llyg/μ L Hca-P蛋白溶于8Μ尿素的蛋白加入二硫苏糖醇至终浓度为1mM经过56°C变性还原后，加入碘乙酰胺至终浓度为20mM，避光反应40min，后将尿素稀释至IM以下，按照1:50(酶/蛋白，w/w)加入Lys-C在37 °C酶解过夜。上述酶解产物分别用⑶巩NaCNBDjP 13OT2O NaCNBH3标记，方法为:轻标记时，每100 μ g蛋白质加入16μ L4%13CD20(v/v)和16 μ L0.6Μ NaCNBH3 ;重标记时，每100 μ g蛋白质加入16μ L4%CD20(v/v)和16yL0.6M NaCNBD3。标记原理如图1所示，然后将标记后的肽段按照不同的质量比例(轻标记/重标记=1: 1，5:1，10:1)混合。小鼠腹水型肝癌淋巴道高转移细胞系和低转移细胞系差异蛋白质分析时Hca-P用CD2O, NaCNBD3标记，Hca-F用13OT2O,NaCNBH3标记，标记方法同上述方法。除盐、蒸干后，用含有质量浓度0.1%甲酸的水溶液复溶。 3.LC-MS分析:所有上述制备的样品均采用下面的分析条件和数据处理方法。分析条件:流动相，Buffer A(含有2%ACN和0.1%FA的水溶液，Buffer B (含有98%ACN和 0.1%FA的水溶液)，不同比值的低转移细胞肽段混合物分离梯度为O到lOmin，为0%B，然后进行90min从2%B到35%B的梯度进行分离，流速为300nL/min。 4.LTQ-Orbitrap Velos 米用 DDA 模式，Full MS 扫描在 Orbitrap 上实现，分辨率为60000(m/z=400)，质量范围350-1800;MS2选择最强的三个离子进行碎裂，动态排除采用repeat count=l, durat1n time=30s, exclus1n durat1n=90s, activat1n mode 选择HCD, normalized collis1n energy=40%, isolat1n width=2, activat1n time=0.1ms0MS2分辨率为100K。上述每个样品平行进样三次。 5.数据分析:采集到的raw文件使用MaxQuant (vl.2.2.5)本文档来自技高网...
【技术保护点】
等重二甲基化标记蛋白质定量方法，该方法利用甲醛和氰基硼氢化钠及其各自的同位素形式进行有机组合，对蛋白质酶解产物中的肽段进行标记，使得肽段在质谱的一级谱上具有相近质荷比而在二级谱上具有不同质荷比,从而在二级谱上实现蛋白质定量分析。
【技术特征摘要】
1.等重二甲基化标记蛋白质定量方法，该方法利用甲醛和氰基硼氢化钠及其各自的同位素形式进行有机组合，对蛋白质酶解产物中的肽段进行标记，使得肽段在质谱的一级谱上具有相近质荷比而在二级谱上具有不同质荷比，从而在二级谱上实现蛋白质定量分析。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 所述一级谱相近质荷比是指含有一个氨基的肽段在MSl质荷比相差5.84mDa,含有两个氨基的肽段在MSl质荷比相差11.68mDa，通过常规的实验所使用的分辨率难以分辨这微小的差异，从而在MSl上呈现为等重状态，二级谱差异是指轻重标记的肽段的碎片离子相差 5.84mDa。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于: 甲醛和氰基硼氢化钠及其同位素形式进行有机组合，对肽段进行标记，是指:肽段分别用轻标记试剂和重标记试剂进行同位素标记； 轻标记试剂可以为以下三种:13CH2O,NaCNBH3,13CH2O^NaCNBD3 13CD2CKNaCNBH3 ;相对应的重标记试剂为 CH2O、NaCNBD3, CD2O、NaCNBH3 和 CD2O、NaCNBD3 ； 定义 CH20、13CH2O' CD20、13CD20 为反应试剂，NaCNBH3 和 NaCNBD3 还原试剂； 轻重标记试剂可以为以下三组中的一组或二组以上组合:第一组13CH20、NaCNBH3与CH2O, NaCNBD3,第二组 13CH20、NaCNBD3 与 CD20、NaCNBH3,和第三组 13CD20、NaCNBH3 与 CD20、NaCNBD3。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于: 具体过程如下: 标准蛋白质，细胞蛋白质提取物经过蛋白质变性，还原和烷基化过程处理，用蛋白酶酶解； 酶解产物分别用轻标记试剂和重标记试剂进行同位素标记，具体过程是分别向两份蛋白质酶解产物溶液中分别加入权利要求3中...
【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，周愿，单亦初，杨开广，吴琪，张珅，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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