本发明专利技术公开了一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法。具体而言，本发明专利技术的方法包括下列步骤：1）获得病毒基因组；2）设计并合成引物；3）获得病毒基因组的cDNA；4）对cDNA进行PCR扩增；5）将扩增产物进行酶切，获得重组质粒；6）将重组质粒pT-S1至pT-S9进行酶切，体外转录获得对应的RNA；7）构建带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT-S10-DsRed并获得S10-DsRed RNA；以及8）将上述RNA等摩尔混合，包裹并转染宿主，进而获得病毒。利用本发明专利技术建立的方法可以在家蚕细胞中表达红色荧光蛋白，进而有可能获得人们所需的重组质型多角体病毒生物杀虫剂。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于病毒基因工程领域，具体涉及一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型 多角体病毒的构建方法。
技术介绍
呼肠孤病毒科（Reoviridae)病毒是一类能感染动物、植物以及真菌的双链RNA (dsRNA)病毒。质型多角体病毒（Cytoplasmic polyhedrosis virus，简称CPVs)是呼肠孤 病毒科质型多角体病毒属（Cypovirus)中的成员，其基因组由9至11个双链RNA片段组成。 CPVs是农林害虫的重要病原，能感染鳞翅目（Ze/?i￡/o/7te_ra)、膜翅目（办膨和鞘翅 目（Cbhoptera)昆虫，在害虫自然种群控制方面发挥重要的作用，是一种极具开发潜力的 生物杀虫剂。 根据CPVs基因组dsRNA在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迀移模式，CPVs可分为20种 不同的类型。家香细胞质型多角体病毒（及咖cytoplasmic polyhedrosis virus， BmCPV)是CPV1型中的典型种。 你处_因编码的红色荧光蛋白（DsRed)由225个氨基酸组成，相对分子质量为 25. 9ku。它的一级结构与绿色荧光蛋白（GFP)的同源性很低(仅为23%)，但它们的二级结 构很相似。与GFP相比，红色荧光蛋白（DsRed)的激发和发射波长较长，其发射峰位于培养 基、组织培养器材及细胞成分等产生的荧光背景范围之外，具有较高的信噪比，而且在细胞 内荧光转换效率高，更易检测。 由于家蚕细胞质型多角体病毒基因组由S1至S10共计10个双链RNA片段组成， 常规方法难以通过遗传操作来构建重组家蚕质型多角体病毒表达外源基因。至目前为止， 未见体外构建重组家蚕质型多角体病毒表达外源基因的报道，也未见构建其他重组质型多 角体病毒表达外源基因的报道。因此，开发一种重组质型多角体病毒表达外源基因的构建 方法将会弥补现有技术中的空白，将会为今后的科研及开发提供强有力的技术支持。
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术的目的在于提供一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多 角体病毒的构建方法。 为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案如下所述： ，其包括下列步骤： (1) 获得家蚕质型多角体病毒基因组； (2) 根据家蚕质型多角体病毒基因组Sl、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双 链 RNA 的末端序列，设计并合成 10 对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、 PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的 编号情况如下： 引物 PS1F 对应 SEQ ID N0:1，引物 PS1R 对应 SEQ ID N0:2， 引物卩52卩对应5￡〇10勵:3，引物卩521?对应5￡〇10勵:4， 引物 PS3F 对应 SEQ ID NO: 5,引物 PS3R 对应 SEQ ID NO:6， 引物 PS4F 对应 SEQ ID NO: 7,引物 PS4R 对应 SEQ ID NO:8， 引物 PS5F 对应 SEQ ID NO:9,引物 PS5R 对应 SEQ ID NO: 10， 引物 PS6F 对应 SEQ ID NO: 11，引物 PS6R 对应 SEQ ID NO: 12， 引物 PS7F 对应 SEQ ID NO: 13,引物 PS7R 对应 SEQ ID NO: 14， 引物 PS8F 对应 SEQ ID NO: 15,引物 PS8R 对应 SEQ ID NO: 16， 引物 PS9F 对应 SEQ ID NO: 17,引物 PS9R 对应 SEQ ID NO: 18， 引物？51(^对应5￡〇10勵：19，引物卩5101?对应5￡〇10勵：20， 各个引物的序列如下所示：【主权项】1. ，其包括下列步骤： 1) 获得家蚕质型多角体病毒基因组； 2) 根据家蚕质型多角体病毒基因组Sl、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、SlO片段的双 链RNA的末端序列，设计并合成 10 对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、 PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的 编号情况如下： 引物 PSlF 对应SEQIDNO: 1，引物 PSlR对应SEQIDNO:2， 引物 PS2F 对应SEQIDNO: 3,引物 PS2R对应SEQIDNO:4， 引物 PS3F 对应SEQIDNO: 5,引物 PS3R对应SEQIDNO:6， 引物 PS4F 对应SEQIDNO: 7,引物 PS4R对应SEQIDNO:8， 引物PS5F对应SEQIDNO:9,引物PS5R对应SEQIDNO: 10， 引物PS6F 对应SEQIDNO: 11，引物PS6R对应SEQIDNO: 12， 引物PS7F 对应SEQIDNO: 13,引物PS7R对应SEQIDNO: 14， 引物PS8F 对应SEQIDNO: 15,引物PS8R对应SEQIDNO: 16， 引物PS9F 对应SEQIDNO: 17,引物PS9R对应SEQIDNO: 18， 引物PSlOF对应SEQIDNO: 19,引物PSlOR对应SEQIDN0:20， 所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO: 1至SEQIDNO:20所示； 3) 获得Sl至SlO片段的cDNA; 4) 分别以步骤3)中获得的Sl至SlO片段的cDNA为模板，对应使用步骤2)中合成的 10对引物进行PCR扩增，获得Sl至SlO片段全长cDNA的扩增产物； 5) 将步骤4)中获得的Sl至SlO片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进 行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有Sl至SlO片段全长cDNA的重组质粒pT-Sl、 pT-S2、pT-S3、pT-S4、pT-S5、pT-S6、pT-S7、pT-S8、pT-S9、pT-S10,其中所述限制性内切酶 的使用情况如下： Sl片段全长cDNA的扩增产物用5^1和fecll进行酶切； S2片段全长cDNA的扩增产物用5^1和fecll进行酶切； S3片段全长cDNA的扩增产物用5^1和fecll进行酶切； S4片段全长cDNA的扩增产物用如M和fecll进行酶切； S5片段全长cDNA的扩增产物用办7/?1和fecll进行当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒的构建方法，其包括下列步骤：1）获得家蚕质型多角体病毒基因组；2）根据家蚕质型多角体病毒基因组S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10片段的双链RNA的末端序列，设计并合成10对引物：PS1F/PS1R、PS2F/PS2R、PS3F/PS3R、PS4F/PS4R、PS5F/PS5R、PS6F/PS6R、PS7F/PS7R、PS8F/PS8R、PS9F/PS9R、PS10F/PS10R，其中所述引物的编号情况如下：引物PS1F对应SEQ ID NO:1，引物PS1R对应SEQ ID NO:2，引物PS2F对应SEQ ID NO:3，引物PS2R对应SEQ ID NO:4，引物PS3F对应SEQ ID NO:5，引物PS3R对应SEQ ID NO:6，引物PS4F对应SEQ ID NO:7，引物PS4R对应SEQ ID NO:8，引物PS5F对应SEQ ID NO:9，引物PS5R对应SEQ ID NO:10，引物PS6F对应SEQ ID NO:11，引物PS6R对应SEQ ID NO:12，引物PS7F对应SEQ ID NO:13，引物PS7R对应SEQ ID NO:14，引物PS8F对应SEQ ID NO:15，引物PS8R对应SEQ ID NO:16，引物PS9F对应SEQ ID NO:17，引物PS9R对应SEQ ID NO:18，引物PS10F对应SEQ ID NO:19，引物PS10R对应SEQ ID NO:20，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:20所示；3）获得S1至S10片段的cDNA；4）分别以步骤3）中获得的S1至S10片段的cDNA为模板，对应使用步骤2）中合成的10对引物进行PCR扩增，获得S1至S10片段全长cDNA的扩增产物；5）将步骤4）中获得的S1至S10片段全长cDNA的扩增产物分别使用限制性内切酶进行酶切，然后克隆到质粒载体中，获得分别带有S1至S10片段全长cDNA的重组质粒pT‑S1、pT‑S2、pT‑S3、pT‑S4、pT‑S5、pT‑S6、pT‑S7、pT‑S8、pT‑S9、pT‑S10，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：S1片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S2片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S3片段全长cDNA的扩增产物用SacI和SacII进行酶切；S4片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S5片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S6片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S7片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和XbaI进行酶切；S8片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S9片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；S10片段全长cDNA的扩增产物用kpnI和SacII进行酶切；6）将步骤5）中获得的pT‑S1至pT‑S9重组质粒分别使用限制性内切酶进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S1至S9片段的RNA，其中所述限制性内切酶的使用情况如下：重组质粒pT‑S1用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S2用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S3用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S4用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S5用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S6用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S7用XbaI进行酶切；重组质粒pT‑S8用SacII进行酶切；重组质粒pT‑S9用SacII进行酶切；7）构建带有红色荧光蛋白基因的重组质粒pT‑S10‑DsRed，将其进行酶切、线性化后，作为模板备用，经过体外转录，获得S10‑DsRed RNA，其中所述红色荧光蛋白基因的5'端带有对应于家蚕质型多角体病毒基因组S10片段的5'非编码区的cDNA序列、3'端带有对应于S10片段的3'非编码区的cDNA序列，所述重组质粒pT‑S10‑DsRed用SacII进行酶切；8）将步骤6）中获得的S1至S9片段的RNA及步骤7）中获得的S10‑DsRed RNA等摩尔混合，使用脂质体进行包裹并转染宿主，待观察到宿主的细胞内发出红色荧光时，收集细胞并粉碎，离心纯化，获得表达红色荧光蛋白的重组家蚕质型多角体病毒。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：贡成良，曹广力，薛仁宇，胡小龙，郭睿，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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