一种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法，旨在提供一种安全的能将苯基甲烷类染料脱色酶大量胞外分泌表达的工程菌株。本发明专利技术的技术方案是从嗜水气单胞菌ＤＮ３２２克隆三苯基甲烷类染料脱色酶ＴｐｍＤ基因；将三苯基甲烷类染料脱色酶ＴｐｍＤ基因与表达载体ｐＰＩＣＺａＡ载体连接，构建质粒ｐＰＩＣＺａＡ－ｔｐｍＤ；将构建的质粒ｐＰＩＣＺａＡ－ｔｐｍＤ酶切线性化后，导入毕赤酵母菌Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｘ－３３中；测定三苯基甲烷类染料脱色酶ＴｐｍＤ基因转化进入了毕赤酵母菌Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｘ－３３中，从而得到转基因毕赤酵母基因工程菌株。本发明专利技术主要用于环境修复和治理中。

【技术实现步骤摘要】

-本专利技术属于生物
，具体涉及。
技术介绍
三苯基甲垸类染料是仅次于偶氮染料的一大类染料，应用广泛，由于其具有生物毒性及 致癌、致畸、致突变的"三致"作用已严重威胁到人类健康及生态平衡。其中的孔雀石绿更是 由于曾被广泛用作水产养殖的防霉剂导致在水体及鱼体中残留而引起世人的广泛关注。近年对印染废水的物理、化学及生物处理方法进行了多方面的研究，己取得一定的进展。物理、化学方法主要包括以无机和有机高分子絮凝剂为主的絮凝法，以臭氧、H2Cb和Fenton 试剂、Cl20为主的氧化法，利用氧化还原、电凝聚及电气浮等作用的电化学法，利用光催化 氧化法的光化学法，利用吸附剂的吸附法和利用超滤或反渗透技术的膜分离法等。这些方法 均有成本高和造成二次污染等缺点。嗜水气单胞菌^era附omw /^c/rop/H'/fl subsp. DN322是从印染废水处理厂的活性污泥中分 离到的一株对结晶紫、碱性品红、灿烂绿及孔雀绿等多种三苯基甲烷类染料具有高效脱色能 力的嗜水气单胞菌。从该菌中分离到一种新的三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD基因，三苯基 甲烷类染料脱色酶TpmD蛋白分子量为58.8kDa，等电点为5.6。酶蛋白是由两个相同分亍量 的亚基组成的二聚体，每个亚基的分子量为29.4kDa。该酶能够催化结晶紫、碱性品红、灿 烂绿及孔雀石绿等多种三苯基甲垸类染料脱色降解，对底物具有结构专一性。脱色酶TpmD 催化的脱色反应依赖于分子氧和辅酶NADH或NADPH的存在，属于NADH/NADPH依赖 型的氧化酶类。酶的分子结构中含有血红素卟啉环，催化活性受细胞色素P450特异性抑制剂 的强烈抑制，催化反应中有自由基的参与，这三方面特性与P450单加氧酶十分相似，但光谱 特征上却没有典型P450单加氧酶在450nm处所特有的特征吸收峰("细菌脱色酶TpmD对 三苯基甲垸类染料脱色的酶学特性研究"，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生 物学报，第46巻第3期，第385 389页，2006年4月)
技术实现思路
-为了充分发挥嗜水气单胞菌DN322三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD在三苯基甲烷染料染 料治理中的作用，实现该酶的大规模产业化应用，首先要实现该酶的大量、稳定表达，并可 分泌到胞外。但是嗜水气单胞菌对鱼类、蛙类具有潜在的致病性从而限制了该菌株在环境生 物修复中的广泛应用。而毕赤酵母表达系统是近年来发展起来的一种高效的真核表达系统，它具有表达量高、稳定性好、酶活性高、能分泌至胞外、便于工业化生产等优点，因而可用 于酶制剂的产业化发酵生产。基于上述专利技术构思，本专利技术的目的是提供了一种能胞外分泌三苯基甲垸类染料脱色酶， 裂解三苯基甲烷类染料骨架结构，进行氧化脱色的转基因毕赤酵母工程菌株及其构建方法。本专利技术通过下述方案予以实现的本专利技术所述的转基因毕赤酵母基因工程菌株，是将嗜水气单胞菌DN322中的三苯基甲烷 类染料脱色酶TpmD基因，其DNA序列如SEQ1所示，编码的蛋白序列三苯基甲垸类染料 脱色酶TpmD如SEQ2所示，与表达载体连接后导入毕赤酵母i^&a戸Wo^ X-33，构建而成 的转基因工程菌，该菌能胞外分泌三苯基甲烷类染料脱色酶。所述转基因毕赤酵母基因工程菌株的构建方法，其步骤如下a) 从嗜水气单胞菌DN322克隆三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD基因；b) 将三苯基甲垸类染料脱色酶TpmD基因与表达载体pPICZaA载体连接，构建质粒 pPICZaA國tpmD;c) 将构建的质粒pPICZaA-tpmD酶切线性化后，导入毕赤酵母菌尸/c/^X-33中；d) 测定三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因转化进入了毕赤酵母菌尸/c/ /a;7a^0& X-33 中，从而得到转基因毕赤酵母基因工程菌株。本专利技术所构建的工程菌的活性测定是通过将工程菌经甲醇诱导表达后，通过对三苯基甲 烷类染料的脱色来测定的。用于本专利技术的嗜水气单胞菌DN322,已经在文献中公开记载(参考文献"细菌脱色酶 TpmD对三苯基甲烷类染料脱色的酶学特性研究"，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国 萍微生物学报，第46巻第3期，第385 389页，2006年4月；"细菌脱色酶TmpD的酶 学特性研究"，任随周，郭俊，王亚丽，岑英华，孙国萍微生物学报，第46巻第5期，第 823 826页，2006年10月)，上述微生物本申请人也持有，并且保证可以在本专利技术申请日起 20年内向公众提供。本专利技术成功的构建了转基因毕赤酵母基因工程菌株，实验证明该工程菌能在胞外分泌三 苯基甲烷类染料脱色酶，并具有较高的活性。本工程菌的成功构建实现了安全的将苯基甲垸 类染料脱色酶大量胞外分泌表达，该脱色酶可与酶制剂载体混合制成可用于印染废水治理和 水产养殖水体净化的酶制剂，用于环境的生物修复。工程菌的构建成功为该酶的大规模产业 化应用于三苯基甲烷染料治理中奠定了基础。 附图说明图1是三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因的PCR扩增结果电泳图，其中泳道M为DNAMarker (DL2000)， 1为三苯基甲烷类染料脱色酶TpmD基因扩增产物。图2是重组质粒pMD18-T-tpmD的酶切鉴定结果电泳图，其中M为DNA Marker (DL2000);泳道1为pMD18-T-tpmD用EcoR I和Not I双酶切的结果。图3是重组表达载体pPICZaA-tpmD的酶切鉴定结果电泳图，泳道M为DNA Marker (DL5000);泳道1为重组表达载体pPICZaA-tpmD用EcoR I和Not I双酶切鉴定结果。图4是重组表达载体pPICZaA-tpmD的Sac I线性化结果电泳图，泳道M为DNA Marker (DL5000);泳道1为重组表达载体pPICZaA-tpmD用Sac I酶切线性化结果。 具体实施例方式以下实施例是对本专利技术的具体说明，不是对本专利技术的限制。实施例1: (O扩增引物合成根据已获得的TpmD基因序列和穿梭质粒载体pPICzaA (从lnvitrogen公司购买)的克 隆位点设计PCR扩增引物。上游引物长34个碱基N-EcoR I : 5，-AGACTGAATTCATGTCAATTGCGGTT ACAGGTGC-3，(下划线处为内切酶EcoR I位点)，下游引物长33个碱基C-Not I: 5，-TATCAGCGGCCGCCATTTTCAGGGCTTGTTTTA-3， (下划线处为内切酶NotI位点)。引物由上海生工生物工程有限公司合成，经PAGE纯化。(2) 目的基因TpmD的PCR扩增 以嗜水气单胞菌DN322总DNA为模板，以N-EcoR I和C-Notl为引物进行PCR扩增。反应体系为200ul，反应组分为灭菌双蒸水165ul; lOxpfoTaq Buffer 20ul; 10mMdNTP4ul; N誦EcoRI4ul; C國Notl4ul; DN322总DNA lul; pftiTaq酶2ul。其反应参数为94。C预变性 5min; 94。C变性45s; 54。C退火45s; 72。C延伸2min， 30个循环;72"C再延伸10min。 1%琼 脂糖检测PCR结果，电泳结果如图l所示，结果表明克隆到了目的基因TpmD，测序，其序 列如SEQ1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因毕赤酵母工程菌株，其特征在于所述的工程菌株是将嗜水气单胞菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ　ｓｕｂｓｐ　ＤＮ３２２中的三苯基甲烷类染料脱色酶ＴｐｍＤ基因与表达载体ｐＰＩＣＺａＡ连接后导入毕赤酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　Ｘ－３３，构建而成的转基因工程菌，所述的转基因工程菌能胞外分泌三苯基甲烷类染料脱色酶，所述的ＴｐｍＤ基因序列如ＳＥＱ１所示，所述的三苯基甲烷类染料脱色酶的蛋白序列如ＳＥＱ２所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙国萍，张培培，任随周，许玫英，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]