一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体，其构筑单元以胱氨酸桥式双β-环糊精为主体，以金刚烷聚乙烯亚胺为客体，通过主客体诱导聚集构筑的二元超分子聚集体并可有效的凝聚质粒DNA，所述聚集体与质粒DNA氮/磷比为20时，所形成纳米粒子的粒径大小为83nm；用于负载质粒DNA作为基因运输的载体并将绿色荧光蛋白质粒DNA转染进入293T细胞。本发明专利技术的优点是：该聚集体能够有效地通过静电相互作用与带负电的质粒DNA形成复合物，转染效率高；由于二硫键的存在，进入细胞后在高浓度的谷胱甘肽作用下可以降解，降低了其毒副作用；该聚集体的制备工艺简单、易于实施且材料成本低，在基因传递领域具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体及其应用
本专利技术涉及生物基因治疗技术，特别是一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体及其应用。
技术介绍
目前应用于基因治疗的载体主要分为两类，即病毒类载体和非病毒类载体。病毒类载体虽然具有高效的转染效率，但其安全性低、免疫原性高且制备复杂。与病毒类载体相比，非病毒基因载体由于其低免疫原性、良好的生物相容性以及令人满意的基因负载能力，在近几年被广泛的研究。聚乙烯亚胺(PEI)是一种常用的阳离子聚合物非病毒基因载体，它是由单体(-CH2-CH2-NH-)构成的具有伯胺、仲胺和叔胺基团的水溶性聚合物。PEI单体中每3个原子含1个胺基，这些胺基的pKa值各有不同，使聚乙烯亚胺（PEI）几乎在任何pH条件下都有被质子化的可能，从而使其富含正电荷，能够较强的结合DNA和粘附细胞作为基因传递的载体。尤其是分子量为25kDa的支链型聚乙烯亚胺常被作为非病毒基因载体的黄金标准。聚乙烯亚胺的转染效率受其分子量的影响，高分子量的聚乙烯亚胺虽然具有高效的转染效率，但是由于其自身大量正电荷的存在以及其非生物降解性，使其具有较高的细胞毒性。目前，最有效的方法之一就是利用可降解的共价键将低分子量的聚乙烯亚胺连接起来，这样既可以降低其毒性又可以保持其具有高效的转染效率。与共价键相比，超分子非共价键相互作用具有方便的合成方法、可控的分子识别、合适的键合常数以及容易自聚集等优点。环糊精由于其令人满意的水溶性、良好的生物相容性以及非免疫原性被广泛的用在生物领域。此外，环糊精和客体分子的诱导聚集为构建高效的基因载体提供了一种简单方便的方法。因此，将主客体诱导聚集应用到非病毒类基因载体的构建上具有很好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术分析和存在问题，提供一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体及其应用，该聚集体基于桥式双环糊精和金刚烷聚乙烯亚胺主客体诱导聚集构筑，可以有效的凝聚并且负载DNA，并且由于聚集体中二硫键的存在，进入细胞后在高浓度的谷胱甘肽作用下可以降解且转染效率高、毒副作用低、制备方法简单、产率较高，适于放大合成和实际生产应用。本专利技术的技术方案：一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体，其构筑单元以胱氨酸桥式双β-环糊精为主体（LCD），以金刚烷聚乙烯亚胺为客体（PEI-Ada），通过主客体诱导聚集构筑的二元超分子聚集体并可有效的凝聚质粒DNA，其中胱氨酸桥式双β-环糊精的化学分子式为C48H84N2O22S2，金刚烷聚乙烯亚胺平均一条高分子链上修饰13.7个金刚烷单元，该聚集体构筑单元的结构如下：。所述聚集体与质粒DNA氮/磷比为20时，所形成纳米粒子的粒径大小为83nm，表面电势为27.2mV，能够有效地通过静电相互作用与带负电的质粒DNA形成复合物。一种所述基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体的制备方法，包括以下步骤：1）在氮气氛围下，将金刚烷乙酸溶于无水乙醇中得到金刚烷乙酸-乙醇溶液，然后将溶有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液加入到上述金刚烷乙酸-乙醇溶液中，搅拌反应30min，得到反应液；2）将分子量为10000的聚乙烯亚胺溶于无水乙醇中，加入到上述反应液中，在25℃条件下搅拌24小时，然后装入截留范围为8000-14000的透析袋中连续透析5天，将所得透析液冻干后即可制得金刚烷修饰聚乙烯亚胺（PEI-Ada）；3）将上述金刚烷修饰聚乙烯亚胺溶于水中，然后加入胱氨酸桥式双β-环糊精并混合均匀，即可制得基于主客体诱导聚集构筑的聚集体。所述金刚烷乙酸-乙醇溶液中金刚烷乙酸与乙醇的用量比为0.058mol/L；在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐-N-羟基琥珀酰亚胺-乙醇溶液中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺与乙醇的用量比均为0.151mol/L；反应液中金刚烷乙酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为0.58：0.754：0.754。所述聚乙烯亚胺和乙醇的用量比0.001mol/L，金刚烷乙酸与聚乙烯亚胺的摩尔比为0.58：0.01。所述金刚烷修饰聚乙烯亚胺与水的用量比为0.397mmol/L，金刚烷修饰聚乙烯亚胺与胱氨酸桥式双β-环糊精的摩尔比为0.397：0.121。一种所述基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体的应用，用于负载质粒DNA作为基因运输的载体并将绿色荧光蛋白质粒DNA转染进入293T细胞，负载质粒DNA的聚合物溶液的制备方法如下：将制得的聚集体和质粒DNA分别溶于水中得到浓度为0.397mmol/L的聚集体溶液和浓度为0.1mg/μL的质粒DNA溶液，将20μL聚集体溶液与20μL质粒DNA溶液混合，混合液中的氮/磷比为20，振荡5秒钟后，室温下静置30min，即可制得负载了质粒DNA的聚合物溶液。本专利技术的优点是：该基于主客体诱导聚集构筑的聚集体能够有效地通过静电相互作用与带负电的质粒DNA形成复合物，并且保持聚乙烯亚胺原有的质子海绵效应，使其从溶酶体里面逃逸出来，避免DNA降解，具有较高的转染效率；由于二硫键的存在，进入细胞后在高浓度的谷胱甘肽作用下可以降解，降低了其毒副作用；该聚集体的制备工艺简单、易于实施且材料成本低，在基因传递领域具有广阔的应用前景。【附图说明】图1为金刚烷聚乙烯亚胺和聚集体的合成路线图。图2为基于主客体诱导聚集构筑的聚集体与质粒DNA作用示意图。图3为基于主客体诱导聚集构筑的聚集体与质粒DNA形成复合物的原子力显微镜图。图4为293T细胞的细胞毒性实验结果。图5为293T细胞转染绿色荧光蛋白质粒后的荧光图。图6为293T细胞转染绿色荧光蛋白质粒后的流式细胞仪分析结果。【具体实施方式】下面通过实例对本专利技术做进一步的说明：实施例：一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体，其构筑单元以胱氨酸桥式双β-环糊精为主体（LCD），以金刚烷聚乙烯亚胺为客体（PEI-Ada），通过主客体诱导聚集构筑的二元超分子聚集体并可有效的凝聚质粒DNA，其中胱氨酸桥式双β-环糊精的化学分子式为C48H84N2O22S2，金刚烷聚乙烯亚胺平均一条高分子链上修饰13.7个金刚烷单元，该聚集体构筑单元的结构如下：；所述聚集体与质粒DNA氮/磷比为20时，所形成纳米粒子的粒径大小为83nm，表面电势为27.2mV，能够有效地通过静电相互作用与带负电的质粒DNA形成复合物。一种所述基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体的制备方法，步骤如下：1）在氮气氛围下，将112.68mg（0.58mmol）金刚烷乙酸溶于10mL无水乙醇中得到金刚烷乙酸-乙醇溶液，然后将溶有144.54mg（0.754mmol）1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和86.78mg（0.754mmol）N-羟基琥珀酰亚胺的5mL乙醇溶液加入到上述金刚烷乙酸-乙醇溶液中，搅拌反应30min，得到反应液；2）将100mg（0.01mmol）分子量为10000的聚乙烯亚胺溶于10mL无水乙醇中，加入到上述反应液中，在25℃条件下搅拌24小时，然后装入截留范围为8000-14000的透析袋中连续透析5天，将所本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体，其特征在于：构筑单元以胱氨酸桥式双β‑环糊精为主体（LCD），以金刚烷聚乙烯亚胺为客体（PEI‑Ada），通过主客体诱导聚集构筑的二元超分子聚集体并可有效的凝聚质粒DNA，其中胱氨酸桥式双β‑环糊精的化学分子式为C48H84N2O22S2，金刚烷聚乙烯亚胺平均一条高分子链上修饰13.7个金刚烷单元，该聚集体构筑单元的结构如下： 。
【技术特征摘要】
1.一种基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体，其特征在于：构筑单元以胱氨酸桥式双β-环糊精为主体(LCD)，以金刚烷聚乙烯亚胺为客体(PEI-Ada)，通过主客体诱导聚集构筑的二元超分子聚集体并可有效的凝聚质粒DNA，其中胱氨酸桥式双β-环糊精的化学分子式为C48H84N2O22S2，金刚烷聚乙烯亚胺平均一条高分子链上修饰13.7个金刚烷单元，该聚集体构筑单元的结构如下：2.根据权利要求1所述基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体，其特征在于：所述聚集体的氮元素与质粒DNA的磷元素的摩尔比为20时，所形成纳米粒子的粒径大小为83nm，表面电势为27.2mV，能够有效地通过静电相互作用与带负电的质粒DNA形成复合物。3.一种如权利要求1所述基于桥式双环糊精主客体诱导聚集构筑的聚集体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)在氮气氛围下，将金刚烷乙酸溶于无水乙醇中得到金刚烷乙酸-乙醇溶液，然后将溶有1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的乙醇溶液加入到上述金刚烷乙酸-乙醇溶液中，搅拌反应30min，得到反应液；2)将分子量为10000道尔顿的支链型聚乙烯亚胺溶于无水乙醇中，加入到上述反应液中，在25℃条件下搅拌24小时，然后装入截留分子量范围为8000-14000道尔顿的透析袋中连续透析5天，将所得透析液冻干后即可制得金刚烷聚乙烯亚胺(PEI-Ada)；3)将上述金刚烷聚乙烯亚胺溶于水中，然后加入胱氨酸桥式双β-环糊精并混合均匀，即可制得基于主客体诱导聚集构筑的聚集体。4.根据权利要求3所述基于桥式...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘育，张玉辉，张瀛溟，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。