能生产活性重组藻胆蛋白的微生物及其制备方法技术

一种新的大肠杆菌菌株Ｐ１及其制备方法，该菌株能利用Ｐｔａｃ启动子高效表达具有抑瘤活性的重组藻胆蛋白。该菌株是由蓝藻中克隆的藻胆蛋白基因与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因构成的嵌合基因转化大肠杆菌后经筛选获得的。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，特别是涉及一种能生产活性重组藻胆蛋白的大肠杆菌新菌株及其制备方法。海洋是地球生命的摇篮。海洋生物富含各种生物活性物质。海洋中的光合生物蓝藻是早在35亿年前就出现在地球上的化石生物。由于这些化石生物的光合作用才形成了地球的含氧大气层，从而使地球上的各种生命得以繁荣发展，延续生存。蓝藻进行光合作用的天线色素蛋白是藻胆蛋白。近年，国外有人用从天然蓝藻中提取的藻胆蛋白饲喂患有肝癌的大鼠，5周后，治疗组有90％活下来，而未治疗组只成活25％。8周后，治疗组有25％大鼠存活，而未治疗组大鼠全部死亡。试验说明蓝藻藻胆蛋白具有显著的抗癌作用，能够提高患癌生物的存活率。现有的大量获取藻胆蛋白的技术，均是将天然蓝藻进行人工培养，然后从蓝藻中提取藻胆蛋白，再将所得产品进行纯化后，开发药物。但是，海洋生物的资源量有限，采集、培养费用较高。而生物活性物质含量较少，提纯工艺复杂。因此通常从天然海洋生物中提取活性物质用作药物，难以做到质纯量足、价格低廉的要求。蓝藻的生长，需要特殊的光温和培养基条件，因而培养成本很高。此外，提纯藻胆蛋白的工艺极为复杂，费用很高。如目前已实现大面积培养的螺旋藻价格也在100元人民币/公斤(食品级)以上，医药级的价格更高。国际市场上，用作医药的蓝藻藻胆蛋白的价格高达10万美元/克左右(Sigma公司)。因此，要开发蓝藻藻胆蛋白作为单体抗癌药物，利用现有的提取藻胆蛋白的方法，几乎是不可能的。针对上述现有技术获取蓝藻藻胆蛋白所存在的问题和局限性，本专利技术的目的在于利用基因重组技术，将蓝藻藻胆蛋白基因与微生物(细菌)基因重新组合，使细菌大量廉价生产有活性的重组藻胆蛋白，利用一步纯化工艺获得大量单体，开发单体抗癌药物。本专利技术通过从蓝藻中克隆藻胆蛋白基因，与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(MBP)基因构成嵌合基因，在导入大肠杆菌后在Ptac启动子驱动下在大肠杆菌中获得(MBP+藻胆蛋白)融合蛋白的高效表达，得到能生产活性重组藻胆蛋白的大肠杆菌菌株P1，该菌株已于96年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.0261，建议分类命名Escherichiacoli。上述菌株P1的重组藻胆蛋白经SDS-PAGE电泳得到约60KD条带，该蛋白无色，溶于水，在280nm处有一最大吸收峰，分子量约60KD，其基因核苷酸顺序及氨基酸顺序如下27 54ATG AAA ATA AAA ACA GGT GCA CGC ATC CTC GCA TTA TCC GCA TTA ACG ACG ATGMET Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr Thr MET81 108ATG TTT TCC GCC TCG GCT CTC GCC AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GTA ATC TGGMET Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp135 162ATT AAC GGC GAT AAA GGC TAT AAC GGT CTC GCT GAA GTC GGT AAG AAA TTC GAGIle Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu189 216AAA GAT ACC GGA ATT AAA GTC ACC GTT GAG CAT CCG GAT AAA CTG GAA GAG AAALys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys243 270TTC CCA CAG GTT GCG GCA ACT GGC GAT GGC CCT GAC ATT ATC TTC TGG GCA CACPhe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His297 324GAC CGC TTT GGT GGC TAC GCT CAA TCT GGC CTG TTG GCT GAA ATC ACC CCG GACAsp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser G1y Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp351 378AAA GCG TTC CAG GAC AAG CTG TAT CCG TTT ACC TGG GAT GCC GTA CGT TAC AACLys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn405 432GGC AAG CTG ATT GCT TAC CCG ATC GCT GTT GAA GCG TTA TCG CTG ATT TAT AACGly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn459 486AAA GAT CTG CTG CCG AAC CCG CCA AAA ACC TGG GAA GAG ATC CCG GCG CTG GATLys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp513 540AAA GAA CTG AAA GCG AAA GGT AAG AGC GCG CTG ATG TTC AAC CTG CAA GAA CCGLys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu MET Phe Asn Leu Gln Glu Pro567 594TAC TTC ACC TGG CCG CTG ATT GCT GCT GAC GGG GGT TAT GCG TTC AAG TAT GAATyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu621 648AAC GGC AAG TAC GAC ATT AAA GAC GTG GGC GTG GAT AAC GCT GGC GCG AAA GCGAsn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala675 702GGT CTG ACC TTC CTG GTT GAC CTG ATT AAA AAC AAA CAC ATG AAT GCA GAC ACCGly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His MET Asn Ala Asp Thr729 756GAT TAC TCC ATC GCA GAA GCT GCC TTT AAT AAA GGC 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能生产活性重组藻胆蛋白的微生物，其特征在于所述的微生物是由蓝藻中克隆藻胆蛋白基因，与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）基因构成嵌合基因导入大肠杆菌后，在Ｐｔａｃ启动子驱动下获得融合蛋白（ＭＢＰ＋藻胆蛋白）的高效表达所得到的能生产活性重组藻胆蛋白的大肠杆菌菌株Ｐ１。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦松，李新萍，姜鹏，王希华，曾呈奎，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]