结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种结合藻红胆素（ＰＥＢ）的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，是通过应用藻胆蛋白ｂｅｔａ１５５裂合酶催化藻红胆素与藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，制备结合ＰＥＢ的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本发明专利技术的方法应用生物过程生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，是一种环境友好的生产方法，藻蓝蛋白类荧光蛋白质能应用于食品、保健与医药功能材料领域，特别是应用为生物和医学分子监测领域的荧光探针。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及新型的结合藻红胆素(PEB)的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法。
技术介绍
藻胆蛋白(phycobiliprotein)是蓝藻和红藻光合作用捕光复合物的功能组分。根据其吸收光谱和荧光光谱特征，藻胆蛋白可以分为藻红蛋白(phycoerythrin，简称CPE)、藻红蓝蛋白(phycoerythrocyanin，简称PEC)、藻蓝蛋白(phycocyanin，简称CPC)和变藻蓝蛋白(all叩hycocyanin，简称APC)。 CPE、 PEC、 CPC和APC含alpha和beta亚基，每个亚基中藻胆色素(phycobilin)通过硫醚键与藻胆蛋白脱辅基蛋白(apo-phycobiliprotein)半胱氨酸残基的巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定藻胆蛋白的光谱性质。藻胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得CPE主要吸收约560nm的可见光，发射约 580nm的荧光；PEC吸收约570nm的可见光，发射约630nm的荧光；CPC吸收约620nm的可见光，发射约640nm的荧光；APC吸收约650 660nm的可见光，发射约660 670nm的荧光。CPE结合的辅基色素为藻红胆素(phycoerythrobilin，简称PEB); PEC的alpha亚基结合的辅基色素为藻紫胆素(phycoviolobilin，简称PVB); PEC的beta亚基结合的辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB); CPC和APC结合的辅基色素都为藻蓝胆素PCB。CPC的alpha亚基可以通过大肠杆菌基因工程菌来生产(Tooley A J, Cai Y A, GlazerA N. Biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial C-phycocyanin holo-alpha subunitin a heterologous host . Proc Natl Acad Sci USA, 2001， 98 (19) : 10560 10565)。与前人的方法不同，我们发现Anabaena sp. PCC7120中a"M朋基因编码betal55裂合酶，在其它蓝藻中也存在同源的betal55裂合酶。这类betal55裂合酶不仅能催化藻蓝胆素PCB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成藻蓝蛋白类荧光蛋白质，还能催化藻红胆素PEB与CPC的beta亚基及其同源蛋白质的155位半胱氨酸巯基(或同源的半胱氨酸巯基)共价结合生成一种新型的结合了PEB的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。藻红胆素PEB可由H01、 PebA、 PebB协同催化生成(Alvey， R. M., Karty, J. A. etc丄esions in Phycoerythrin Chromophore Biosynthesis inFremyella diplosiphon Reveal Coordinated Light Regulation of Apoprotein and PigmentBiosynthetic Enzyme Gene Expression. Plant Cell 15 (10)， 2448-2463 (2003))。在绝大部分的蓝藻和红藻中，都存在有编码CPE脱辅基蛋白、CPC脱辅基蛋白、APC脱辅基蛋白、betal55裂合酶以及PEB生物合成所需的酶的基因，其中某些缺乏PE而具有异形胞的蓝藻中存在PEC;隐藻中没有藻胆体，不存在上述基因中的APC的基因。藻胆蛋白类荧光蛋白质可以应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域。目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取(高纯度藻胆蛋白的分离方法，CN1344723，2002.04.17。 一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法，CN1563083, 2005.01.12)。本方法不利用藻类作为原料，而是利用基因工程方法生产新型的藻蓝蛋白。藻蓝蛋白类荧光蛋白质具有优良的荧光性质，这种结合PEB的新型藻蓝蛋白，为开发新型荧光探针提供了更多的选择。本方法为藻蓝蛋白类色素蛋白质功能材料应用于食品、化妆品、医药和生物工程领域奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，它是应用betal55裂合酶催化PEB与藻蓝蛋白类脱辅基蛋白共价结合，从而制备新型藻蓝蛋白类荧光蛋白质(天然状态下藻蓝蛋白类脱辅基蛋白是与PCB结合)。将含有betal55裂合酶基因、藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因和PEB生物合成酶基因的表达质粒依次转入宿主菌，得到相应的工程菌，通过如此设计的基因工程菌生产新型藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本专利技术的技术方案是这样的 一种，包括下述步骤(1) 用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到betal55裂合酶表达质粒；(2) 用基因工程方法，将藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因力o7和peZ^或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到力o7和pe/^表达质粒；(4) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因peM或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到pe^表达质粒；(5) 将betal55裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、力o7和pe力5表达质粒及peW表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。本专利技术的技术方案也可以是这样的 一种结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，包括下述步骤(1) 用基因工程方法，将betal55裂合酶基因或其同源基因和藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基 因或其同源基因同时克隆于表达载体中，得到betal55裂合酶和脱辅基蛋白表达质粒；(2) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因力o7和/^力5或其同源基因克隆于第 三个表达载体中，得到Z o7和； e/^表达质粒；(3) 用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因peW或其同源基因克隆于第四个表 达载体中，得到peW表达质粒；(4) 将betal55裂合酶和脱辅基蛋白表达质粒、力o7和pe65表达质粒及/ eM表达质粒 依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主菌后，得到相应的工程菌，应用此工程 菌通过发酵工程生产结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技 术，提纯得到相应的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。上述中，所述的宿主菌为大肠杆；所 述的betal55裂合酶基因是指与^a/ ae朋sp. PCC7120中3"MW基因同源的基因；所述的 藻蓝蛋白类脱辅基蛋白基因是指与^afee朋sp. PCC7120或M J柳i/ os"s sp. PCC7603中 M"基因同源的基因。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点1、 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产藻蓝蛋白类荧光蛋白质，大肠杆菌繁殖快， 可以大大縮短周期；2、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质的制备方法，其特征在于包括下述步骤：　（１）用基因工程方法，将ｂｅｔａ１５５裂合酶基因或其同源基因克隆于表达载体中，得到ｂｅｔａ１５５裂合酶表达质粒；　（２）用基因工程方法，将藻蓝蛋白类脱辅 基蛋白基因或其同源基因克隆于第二个表达载体中，得到脱辅基蛋白表达质粒；　（３）用基因工程方法，将藻红胆素生物合成酶基因ｈｏ１和ｐｅｂＢ或其同源基因克隆于第三个表达载体中，得到ｈｏ１和ｐｅｂＢ表达质粒；　（４）用基因工程方法，将藻 红胆素生物合成酶基因ｐｅｂＡ或其同源基因克隆于第四个表达载体中，得到ｐｅｂＡ表达质粒；　（５）将ｂｅｔａ１５５裂合酶表达质粒、脱辅基蛋白表达质粒、ｈｏ１和ｐｅｂＢ表达质粒及ｐｅｂＡ表达质粒依次转入配套的宿主菌，当这些表达质粒都转入宿主 菌后，得到相应的工程菌，应用此工程菌通过发酵工程生产结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质；发酵后，按常规蛋白质提纯技术，提纯得到相应的结合藻红胆素的藻蓝蛋白类荧光蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：佟顺刚，夏坤，赵开弘，周明，
申请(专利权)人：广州天宝颂原生物科技开发有限公司，华中科技大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]