本发明专利技术涉及以Ｂ－藻红蛋白（Ｂ－Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ；Ｂ－ＰＥ）接合其它化学荧光剂制成的多种荧光标识试剂（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔ）及其套组，其可组成一系列不同发射光谱的荧光族群。本发明专利技术的荧光标识试剂可单独使用或多组同时使用，若同时使用，单一波长光源即可激发出多种荧光，可应用在免疫检验试验、流式细胞仪检验、荧光分析仪等。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及包含B-藻红蛋白及其衍生物的多种荧光标识试剂(Fluorescent labeling reagent)及其套组，是以B-藻红蛋白(Phycoerythrin；B-PE)接合其它化学荧光剂，组成一系列不同发射光谱的荧光族群。
技术介绍
目前已有许多不同型式的标识试剂被使用于生物侦测分析上，例如荧光标示物或染料皆被广泛地应用，例如细胞分类、诊断分析、荧光显微镜、免疫细胞化学定位标示等，其中由于侦测系统的改良，例如电子影像显微镜、流式细胞分析仪(flow cytometers)等，导致荧光标示抗体、DNA探针、生化类似物、细胞、聚合物等的应用在近几年来快速地发展。荧光免疫检测方法是现代常用的生物医学技术之一，可应用在免疫检测分析、疾病筛选、实验室研究等。目前现有荧光试剂已有多种颜色可以选择，但是普遍存在的问题为分子稳定性不高、荧光产生率低、荧光容易被遮蔽、以及激发光源分散不利于同时使用等缺点。因此，未来所发展的荧光标识试剂应符合一个或多个下列的条件增加荧光亮度、改善光安定性、降低非专一性结合、以及激发及放射波长能较符合仪器光源及侦测器的设计。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的便是针对现有技术中的缺点，提供一种包含B-藻红蛋白(B-Phycoerythrin；B-PE)及其衍生物的荧光标识试剂及其套组，其具有较高的荧光亮度、可有效改善光安定性、降低非专一性结合、且激发及放射波长能较符合仪器光源及侦测器的设计。为达到上述目的，本专利技术提供了一种荧光标识试剂，是由B-藻红蛋白接合化学荧光试剂所制成，其中所述化学荧光试剂可由B-藻红蛋白吸收能量传递，进而激发化学荧光剂放射出荧光。同时，本专利技术还提供了一种多色荧光标识试剂套组，其至少包含B-藻红蛋白；及至少一个或一个以上的B-藻红蛋白接合化学荧光试剂所制成的衍生物，其中所述化学荧光试剂可由B-藻红蛋白吸收能量传递，进而激发化学荧光剂放射出荧光。本专利技术中所使用的B-藻红蛋白与目前已被发现的R-藻红蛋白相比具有明显差异，详细情况参见表一。B-藻红蛋白的主要理化特性如下其结构由阿法(α)、贝塔(β)及加玛(γ)三种亚单体(subunit)所组成，通常以六聚体(hexamer，(αβ)6γ)型态出现；分子量为240,000道尔顿(dalton)；吸收光范围落在可见光区，其吸收光谱图如图1中实线所示，吸收光谱的主峰落在545nm，在498nm还有1个肩峰；荧光放射光范围落在可见光区，其荧光发射光谱图如图1中虚线所示，荧光发射光谱的主峰位于575nm；发射荧光亮度强且稳定，受环境pH值、温度及其它生物分子存在的影响小；其最佳激发光波长为543nm，以该波长激发的荧光产生率(fluorescence quantum yield)为0.98。表一、两种藻红蛋白比较表 B-藻红蛋白的藻种培养不容易，所以目前蛋白供应来源少，相对的使用者也较少，但是B-藻红蛋白的荧光产生率(量子转换率)非常高，所以本身就是一个很好的荧光试剂。在适当的条件下，B-藻红蛋白也可以进行有效率的能量传递(也和高量子转换率有关)，所以与一些化学荧光试剂接合后的衍生物，利用B-藻红蛋白吸收光能，经高效率的能量转移，激发接合的化学荧光试剂发出长波长荧光。这种衍生物的优点在于其Stock位移(Stock Shift)被显著地加大，所以背景值被有效地降低。另外，一般的化学荧光试剂因为接合了B-藻红蛋白，其产生的荧光较不容易被遮蔽。目前常见的以激光为激发光源的荧光仪器有流式细胞仪、荧光免疫分析仪、共轭焦显微镜。若使用其它荧光标识剂自行选择组合出多色荧光，往往因为各个荧光标识剂的激发光源不同而须添购多组激光光源，造成仪器成本昂贵。而将本专利技术中的B-藻红蛋白衍生物(即将B-藻红蛋白结合化学荧光试剂)合并使用，只需使用可激发B-藻红蛋白的单一激发光源，即可同时激发出多色荧光，所以本专利技术可有效降低使用成本，并增加使用方便性。此外，多种荧光同时使用时，还要考虑到相互间的可辨识性和干扰性。上述以激光为激发光源的荧光仪器中，其可区分的荧光波长间隔最小约20nm，而本专利技术针对这一限制所设计出来的B-藻红蛋白荧光衍生物，荧光均落在可见光区且彼此间相隔约30nm。当然，本专利技术的以B-藻红蛋白及其衍生物制成的荧光标识试剂，其激发光源并不受特殊限制，只需使用可激发B-藻红蛋白的任何激发光源即可。本专利技术使用的化学荧光试剂，可为任何易与B-藻红蛋白(B-PE或BPE)接合的化学荧光试剂，且可由B-藻红蛋白吸收能量传递至该化学荧光剂，进而激发该化学荧光剂放射出荧光。所述化学荧光试剂例如Texas Red、Cy5、Cy5.5等。本专利技术所制成的荧光标识试剂套组示例如表二所示。表二、荧光标识试剂套组 本专利技术中所述多色荧光标识试剂套组中的试剂，可依据实际情形选择单独使用或多种试剂搭配使用，且使用单一波长的激发光源即可同时侦测不同的荧光放射波长，可节省仪器设备的成本及解决相互干扰的问题。本专利技术的多色荧光标识试剂套组所使用的激发光源波长范围为488nm至633nm，其中最佳使用的激发光源波长为543nm。本专利技术还提供了所述的荧光标识试剂在免疫检验试验、流动细胞仪检验及荧光分析中的应用，这些荧光标识试剂可进一步与蛋白质结合，例如抗原或抗体，从而可应用于免疫检验试验、流动细胞仪检验及荧光分析中。附图说明图1为显示B-藻红蛋白的光谱图。图2为显示本专利技术的四种荧光标识试剂的荧光光谱图。具体实施例方式以下列举本专利技术的优选实施例，进一步详细说明本专利技术的技术，但本专利技术的保护范围并不以此为限。本专利技术的优选实施例(1)、B-藻红蛋白的制备本实施例中B-藻红蛋白的成分规格如下1、吸收光谱值A545nm/A280nm≥5.5、A565nm/A545nm≥0.95、A620nm/A545nm≤0.005；2、蛋白质纯度高于98％；3、保存于150mM磷酸钠缓冲液(Sodium phosphate buffer，pH7.0)中，内含60％饱和硫酸铵(ammonium sulfate)、1mM乙二胺四醋酸盐(Sodium Ethylene-diamine tetraacetate；EDTA)、以及1mM叠氮化钠(sodium azide)，需4℃冷藏。(2)、多色荧光试剂的制备BPE 620是由B-藻红蛋白接合Texas Red(购自Sigma)所组成。将保存在60％饱和硫酸铵溶液中的B-藻红蛋白，利用透析的方法更换至碱性反应缓冲液中，加入溶在二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide；DMSO)中的Texas Red，B-藻红蛋白与Texas Red的摩尔比例约为1∶1，浓度范围为0.1-1mM，室温下避光反应至少4小时，然后以分子筛层析管柱纯化。BPE 660是由B-藻红蛋白接合Cy5(购自Amersham)所组成，BPE 700是由B-藻红蛋白接合Cy5.5(购自Amersham)所组成。两者的制备方法相似，将保存在60％饱和硫酸铵溶液中的B-藻红蛋白，利用透析的方法更换至碱性反应缓冲液中，再加入溶在DMSO中的Cy化学荧光试剂(即Cy5及Cy5.5)，B-藻红蛋白与Cy化学荧光试剂的摩尔比例约为1∶1，浓度范围为0.1-1mM，室本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光标识试剂，是由Ｂ－藻红蛋白接合化学荧光试剂所制成，其中所述化学荧光试剂可由Ｂ－藻红蛋白吸收能量传递，进而激发化学荧光剂放射出荧光。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：阙壮群，
申请(专利权)人：远东生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。