重组藻胆蛋白及其制备方法和应用技术

一种基因重组藻胆蛋白，其特征在于：含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体化地说是一种利用基因工程技术生产的重组藻胆蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
藻胆蛋白是原核藻类--蓝藻，真核藻类--红藻、隐藻和某些甲藻所特有的光合作用捕光色素蛋白。天然藻胆蛋白是藻胆蛋白亚基与藻胆色素共价结合的化合物，并且形成复杂空间结构--藻胆体。根据与藻胆蛋白亚基相结合的藻胆色素不同，藻胆蛋白主要分为藻红蛋白(phycoerythrin，PE)，藻蓝蛋白(phycocyanin，PC)和别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)。自20世纪80年代以来，人们发现藻胆蛋白具有多种生物活性，有着广阔的运用前景。例如藻胆蛋白能够刺激机体免疫系统产生免疫球蛋白，同时能保持或促进正常的细胞功能，全面增强机体的防病、抗病能力，可防止肿瘤或抑制肿瘤的生长和复发，具有抗肿瘤功效(Schwartz，J.Z.，& Shkiar，G..Growthinhibition and destruction of cancer cells by oral extracts of Spirulina，Proc.Amer.Acad Oral Pathol.1986，4023；张素萍，姚思德等，用脉冲辐解法研究藻胆蛋白与羟自由基反应动力学，科学通报，2000，45(1)32)。含有藻胆蛋白的抗肿瘤成分也能用于治疗溃疡和痔疮出血(Dainipponink andChemicals，Antitumoral agents containing phycobilin.J.Phycology 1983，21658)，能够促进末端供血和骨髓造血功能。藻胆蛋白能选择性地富集于病灶，并且有激光激活的细胞毒作用(Morcos N.C.，Bems M.and HenryW.L.Phycocyaninlaser activation，cytotoxic effects，and uptake in humanatherosclerotic plaque.Lasers Surg Med，1988，8(1)10)。美国食品医药局(FDA)已批准将藻胆蛋白用于皮肤癌、乳腺癌的光敏治疗(范晓，海藻化学研究的展望，海洋科学，1996，(2)24)。同时藻胆蛋白于用动脉粥样硬化的光敏治疗也已申请专利(US4886831)。此外藻胆蛋白能够缓解药物和重金属对肾脏的毒害，它的抗病毒活性也得到了多方面证实(CN99110831.0，US6346408)。在食品工程方面，藻胆蛋白的必需氨基酸组成十分理想，是一种理想的食品添加剂。藻胆蛋白荧光特性也可用于荧光探针制作以及免疫分析试剂等。现有获取藻胆蛋白的技术，是从藻类中直接提取纯化。它主要包括一系列长周期、高成本、复杂的过程。这一过程主要包括藻体的培养、收集，藻体细胞的破碎和蛋白质多次抽提。其中蛋白质分离纯化方法主要有碱性磷酸缓冲液抽提、水提法、酸提法、匀浆法、羟基磷灰石柱层析等，具体方法如藻体细胞用0.05mol/L磷酸钠缓冲液悬浮，超声波处理破碎细胞，离心取上清获得可溶性总蛋白；上清液用硫酸铵分级分离，沉淀物用0.05mol/L磷酸钠缓冲液溶解后，以DEAE-SepharoseCL-6B透析柱(用氯化钠洗脱)纯化，纯化产物用SephadexG-100柱进一步纯化和脱盐，收集得到藻蓝蛋白。利用这种技术得到的藻胆蛋白是色素蛋白复合物，没有统一的质量标准，活性不稳定。目前天然藻胆蛋白纯品的售价为每克20万美元(SIGMA公司)，难以大规模应用。
技术实现思路
针对上述现有技术的局限性，本专利技术目的在于提供一种结构单一、活性稳定的重组藻胆蛋白及其制备方法和应用。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现本专利技术基因重组藻胆蛋白是含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物；其中所述多肽为含有一种或几种藻胆蛋白亚基的氨基酸序列；所述多肽含有的藻胆蛋白亚基氨基酸序列包含藻胆蛋白亚基全氨基酸序列，或该序列的片段、或与其具有基本序列同源性的氨基酸序列。其制备方法是利用基因工程技术，将藻胆蛋白亚基基因转入各类表达体系中异源表达，生产含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。在本专利技术中，藻胆蛋白亚基基因的获得是通过分子克隆方法从蓝藻、红藻、隐藻、甲藻和原绿球藻等藻类中克隆得到；而后将藻胆蛋白亚基基因亚克隆到各种载体上，如大肠杆菌(E.coli)的pET、pTrx、pMAL、pGEX等载体系列，芽孢杆菌(Bacillus)pE194Ts等载体系列，酵母pPIC，pMET等载体系列，昆虫细胞pMT，pIB等载体系列，哺乳动物pCDNA，pIND等载体系列；再利用转基因技术中的氯化钙(CaCl2)介导法、聚乙二醇(PEG)法、电激法、超声波导入法、基因枪法、显微注射法、农杆菌Ti质粒转化、植物病毒载体介导等物理、化学或生物的转基因技术等，将藻胆蛋白亚基基因或其重组载体导入各类表达体系中异源表达；运用层析技术生产含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽或其衍生物。获得重组体后，利用快速、简便的生产工艺进行低成本生产，以获得重组藻胆蛋白，一方面可以直接用作药物、保健或功能食品、食品添加剂、试剂等；另一方面可以通过酶解、化学修饰等方式获得衍生物加以应用。本专利技术具有如下优点1.本专利技术为运用基因工程技术，将藻胆蛋白亚基基因转入目前较为成熟的各类表达体系(如大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物、高等植物、海洋生物)中高效表达，生产含有藻胆蛋白亚基氨基酸序列的多肽，并利用简便纯化工艺获得大量廉价、稳定的重组蛋白，用作药物、保健或功能食品、食品添加剂、试剂等。与现有技术相比，这一生产过程避免了藻类养殖这一长周期过程，并且能将藻胆蛋白亚基基因与各类亲和标签(如6×his，GST，Trx等)相融合，利用亲和层析减化下游纯化过程，降低成本。2.运用本专利技术技术方案得到重组藻胆蛋白不具有天然藻胆蛋白的藻胆色素基团，是结构单一的多肽。3.本专利技术结构单一多肽与色素蛋白复合物相比，结构稳定，从而活性稳定，可建立统一质量标准，适于大规模应用。附图说明图1为别藻蓝蛋白基因(apc)的克隆及其在大肠杆菌(E.coli)中表达的载体构建示意图。图2为藻红蛋白基因(pe)在大肠杆菌(E.coli)中表达的载体构建示意图。图3为别藻蓝蛋白基因α亚基(apca)和β亚基(apcβ)分别在大肠杆菌(Ecoli)中表达的载体构建示意图。图4为藻胆蛋白基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)表达的载体构建示意图。图5为藻胆蛋白基因在海带中表达的载体构建示意图。具体实施例方式下面结合附图及实施例进一步描述本专利技术，但并不限制本专利技术的保护范围。特别应指出的是在下列实施例中，使用的DNA提取，PCR扩增反应，表达载体构建等技术是本领域普通技术人员所熟知的，并可在诸如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，科学出版社，1992年第二版)、《PCR技术实验指南》(C.W.迪芬巴赫，GS德维克斯勒等著，黄培堂等译，科学出版社，1998)等参考文献中找到。实施例1利用聚合酶链式反应(PCR)技术从蓝藻中克隆别藻蓝蛋白基因(apc)1.模板DNA的提取100ml组囊藻(Anacystis nidulans)UTEX 625培养液经3,00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦松，林凡，葛保胜，唐志红，赵方庆，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：