生产米尔贝霉素的重组链霉菌及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种生产米尔贝霉素的重组链霉菌，相对于相应的野生型链霉菌或者产生该重组链霉菌的起始链霉菌，所述重组链霉菌选自如下的至少一个基因是失活的：编码SEQ ID NO：8或与其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2、编码SEQ ID NO：9或与其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3、编码SEQ ID NO：10或与其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4和编码SEQ ID NO：11或与其具有至少80％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。本发明专利技术还涉及产生所述重组链霉菌的方法和使用所述重组链霉菌生产米尔贝霉素的方法。

【技术实现步骤摘要】
生产米尔贝霉素的重组链霉菌及其制备方法和应用
本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及制备生产抗生素、特别是米尔贝霉素的重组工程化链霉菌的方法和获得的重组链霉菌及其应用。专利技术背景米尔贝霉素是一种大环内酯类驱虫药物，日本三共株式会社于1967年发现，经过多年改良于1986年正式以商品名米尔贝肟(milbemycinoxime)上市。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的肟衍生物，米尔贝肟对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD50是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。目前能产米尔贝霉素的菌株有米尔贝霉素链霉菌(Streptomycesmilbemycinicus)、冰城链霉菌(Streptomycesbingchenggensis)、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)例如吸水链霉菌金泪亚种(Streptomyceshygroscopicussubsp.aureolacrimosus)和灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)。它们除主要产生有效组分米尔贝霉素A3/A4外，还可产生近三十多种米尔贝霉素类似物，其中常见的有C5-O-甲基米尔贝霉素B2、B3、β1、β2、α9和α10(US4144352)。这些类似物的产生不仅会降低米尔贝霉素A3/A4的产量，而且会严重影响米尔贝霉素A3/A4后期的分离纯化。向文胜等报道通过基因工程改造获得了去除米尔贝霉素B2、B3、β1和β2以及南昌霉素的重组冰城链霉菌(CN103468625B)。但是还有一类米尔贝霉素类似物α9和α10(图1)在米尔贝霉素提取纯化过程中很难彻底去除(TakiguchiYetal.1980,Milbemycins,anewfamilyofmacrolideantibiotics:fermentation,isolationandphysico-chemicalproperties.JAntibiot(Tokyo).1980Oct；33(10):1120-7)。目前本领域尚未鉴别链霉菌中关于米尔贝霉素类似物α9和α10的合成途径，因此没有关于通过改造相关途径而降低或去除米尔贝霉素类似物α9和α10的相关报道。本领域需要能够在生产米尔贝霉素例如米尔贝霉素A3/A4的同时减少或阻断杂质组分例如米尔贝霉素类似物α9和α10的方法和手段。
技术实现思路
本专利技术人意外地发现失活链霉菌中的本专利技术所述基因mpca2、mpca3、mpca4和mpca5中的至少一个时，使用该链霉菌生产米尔贝霉素时能够去除杂质组分米尔贝霉素类似物α9和α10，而不影响或者有利于米尔贝霉素的生产，简化米尔贝霉素提取纯化工艺，降低生产成本。在某些情况中，使用本专利技术的重组链霉菌生产米尔贝霉素时不但能够去除杂质组分米尔贝霉素类似物α9和α10，还能够提高有效组分米尔贝霉素A3/A4的发酵单位。本专利技术提供了一种重组链霉菌，使用该重组链霉菌生产米尔贝霉素时，相对于使用相应的野生型或起始链霉菌生产米尔贝霉素时，降低或完全去除米尔贝霉素类似物α9和α10杂质组分含量。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种重组链霉菌，其中相对于相应的野生型链霉菌或者产生该重组链霉菌的起始链霉菌，所述重组链霉菌选自如下的一个、两个、三个或全部四个基因是失活的：(i)编码SEQIDNO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2；(ii)编码SEQIDNO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3；(iii)编码SEQIDNO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4；(iv)编码SEQIDNO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。在本文中，所述野生型链霉菌是指天然环境中存在的、并未进行任何人工操作的链霉菌。在本专利技术中，产生所述重组链霉菌的起始链霉菌是指对其进行本专利技术所示遗传操作例如基因失活的链霉菌。所述起始链霉菌可以是野生型链霉菌，也可以是具有其它遗传修饰但是不具有本专利技术所述遗传修饰的用于生产米尔贝霉素的链霉菌。如本文所用，“重组”是指由于有意人为干预所获得的具有所需修饰的菌株，例如与相应天然(非重组)菌株相比，重组菌株低表达或者根本不表达特定天然基因或其活性。在本专利技术中，术语“失活”包括部分失活和完全失活，是指基因功能部分或全部丧失，不能产生表达其编码的蛋白质、或蛋白质表达水平降低或消除、或表达的蛋白质的相关生物学活性被降低或消除，例如基因不能被转录或者转录的RNA不能被翻译为具有相应活性的蛋白质、或者产生的蛋白质的量或其活性与未进行所述失活操作的基因翻译的蛋白质的量或活性相比是降低的或者被消除，例如降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％甚至更多、或者被消除(即降低100％)。在本专利技术中，术语“消除”是指与未进行所述遗传操作例如失活操作之前的菌株中存在的相应蛋白的活性相比，进行遗传操作后的菌株中蛋白的活性不可被检测到。在本专利技术中，“至少X％相同性”理解为是指要比较的两个序列的氨基酸残基之间的百分比相同性，其是在所述两个序列的最佳排列对比后获得的。所述最佳排列对比可以通过使用本领域已知的任何方法获得，例如SmithandWaterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源排列算法，PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性搜索方法及这些算法的计算机执行程序，如由NCBI站点上可用的BLASTP计算机软件所使用的那些。本领域技术人员可以合理推断，在同一种属中，与参考蛋白质的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的蛋白质与参考蛋白质在生物体中执行相同的生物学功能。例如，在本专利技术所述链霉菌中，本领域技术人员能够合理预期与SEQIDNO：8所示氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的多肽与由SEQIDNO：8所示氨基酸序列组成的多肽在生物体中执行相同的生物学功能，因此失活与SEQIDNO：8所示氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的多肽可以获得与失活SEQID本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组链霉菌，相对于相应的野生型链霉菌或者产生该重组链霉菌的起始链霉菌，所述重组链霉菌选自如下的任一个、任两个、任三个或全部四个基因是失活的，例如是被敲除的：(i)编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2；(ii)编码SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3；(iii)编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4；(iv)编码SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。

【技术特征摘要】
1.一种重组链霉菌，相对于相应的野生型链霉菌或者产生该重组链霉菌的起始链霉菌，所述重组链霉菌选自如下的任一个、任两个、任三个或全部四个基因是失活的，例如是被敲除的：(i)编码SEQIDNO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2；(ii)编码SEQIDNO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3；(iii)编码SEQIDNO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4；(iv)编码SEQIDNO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。2.权利要求1的重组链霉菌，其选自重组米尔贝霉素链霉菌(Streptomycesmilbemycinicus)、重组冰城链霉菌(Streptomycesbingchenggensis)、重组吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)例如重组吸水链霉菌金泪亚种(Streptomyceshygroscopicussubsp.aureolacrimosus)和重组灰产色链霉菌(Streptomycesgriseochromogenes)。3.权利要求1或2的重组链霉菌，其是以保藏号CGMCCNo.7677保藏在CGMCC的米尔贝霉素链霉菌的重组菌株，其中相对于CGMCCNo.7677链霉菌，所述重组菌株中的基因mpca2、基因mpca3、基因mpca4和基因mpca5的任一个、任两个、任三个或全部四个是失活的。4.权利要求1-3任一项的重组链霉菌，其中所述重组链霉菌的基因组中选自如下的一个或多个核苷酸序列是缺失或敲除的：(i)SEQIDNO：7所示的974-2452位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段，例如SEQIDNO：7所示的x-y位核苷酸，其中x是974至1581的任一整数，y是1834至2452的任一整数，如SEQIDNO：7所示的1581-1834位核苷酸，(ii)SEQIDNO：7所示的2449-3606位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段，例如SEQIDNO：7所示的x-y位核苷酸，其中x是2449至2894的任一整数，y是3305至3606的任一整数，如SEQIDNO：7所示的2894-3305位核苷酸，；(iii)SEQIDNO：7所示的3828-4892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段，例如SEQIDNO：7所示的x-y位核苷酸，其中x是3828至3889的任一整数，y是4495至4892的任一整数，如SEQIDNO：7所示的3889-4495位核苷酸，(iv)SEQIDNO：7所示的620-892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄隽，党福军，周军，徐晴雨，李娜，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33