一种通过表面展示实现人源精氨酸酶‑1固定化的方法技术

本发明专利技术提出了一种通过表面展示实现人源精氨酸酶‑1固定化的方法。步骤为：设计在冰核形成蛋白剪切变体(InaK‑N)的氨基端加入信号肽和带电荷多肽，在羧基端融合人源精氨酸酶‑1，在羧基端设计HA标签；构建各种重组质粒分别转化大肠杆菌感受态细胞，获得不同基因工程菌株；将不同菌株摇瓶培养；检测人源精氨酸酶‑1展示效率和酶活；挑取酶活最高的菌株大量培养，高效转化L‑精氨酸，合成L‑鸟氨酸。本发明专利技术通过冰核形成蛋白剪切变体融合人源精氨酸酶‑1在大肠杆菌细胞表面有效展示，从而实现了人源精氨酸酶‑1固定化。与原始的冰核形成蛋白展示系统相比，明显提高人源精氨酸酶‑1展示效率和酶活，与几丁质固定化法相比，降低成本，缩短流程，简化纯化步骤。

Method for realizing human arginine -1 immobilization by surface display

The invention provides a method for the surface display to achieve the source of arginase 1 immobilized. Design steps: forming protein variants in ice cores (InaK N) N-terminal signal peptide added and charged polypeptides in the C-terminal fusion of human arginase 1, design of HA tag at the C-terminus; construct the recombinant plasmids were transformed into E.coli cells, have different genetic engineering strain the different strains; flask; detection of human arginase 1 shows efficiency and enzyme activity; enzyme activity were the highest strains cultured in a high conversion of L arginine, ornithine synthesis L. The ice nucleation protein fusion splice variant of human arginase 1 in Escherichia coli cell surface display effectively, so as to realize the human arginase 1 immobilized. The formation of protein display system compared with the original ice, significantly improve the human arginase 1 show efficiency and enzyme activity, compared with chitin immobilized method to reduce the cost, shorten the process, simplify the purification steps.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是人源精氨酸酶-1(HumanArginase1)的固定化技术，特别是通过优化的冰核形成蛋白展示来实现固定化的方法，是人源精氨酸酶Ⅰ固定化的一种新思想、新途径、新方法。
技术介绍
人源精氨酸酶-1以三聚体的形式存在于人肝脏细胞之中，参与尿素代谢循环，催化水解L-Arg(L-精氨酸)生成L-Orn(L-乌氨酸)和尿素。精氨酸酶Ⅰ缺陷，会导致发育迟缓，智力缺陷，癫痫和运动失调等一系列相关疾病，人源精氨酸酶-1还可以用于做为药物治疗癌症。由于大部分精氨酸酶难以实现在大肠杆菌中实现高效可溶性表达，从肝脏中提取精氨酸酶作为精氨酸酶主要的来源，但存在着可能携带各种病毒的风险。人源精氨酸酶-1在巴斯德毕赤酵母能够实现有效的分泌表达，纯化的人源精氨酸酶-1，经过几丁质包埋固定以后，实现有效的转化L-Arg合成L-Orn，然而，此固定化方法，制备时间较长，制备过程复杂，在操作过程中，存在损失部分酶活等缺点。大肠杆菌表面展示技术，作为一种全新的固定技术，有广泛的应用前景，诸如，将谷氨酸脱羧酶展示在大肠杆菌表面，重组大肠杆菌细胞可作为“固定化细胞工本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过表面展示实现人源精氨酸酶‑1固定化的方法，其特征在于：1)首先，设计PCR引物分别携带编码信号肽Sec、Tat，带电荷多肽6×Lys、6×Glu、6×Asp和标签蛋白HA的序列，通过PCR将其分别融合在冰核形成蛋白剪切变体(InaK‑N)的氨基端，和人源精氨酸酶‑1的羧基端，然后将两类基因片段通过PCR融合在一起，构建出含有各种含有冰核形成蛋白和精氨酸酶重组表达质粒；2)将构建好的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株Rosetta Blue感受态细胞，37℃静置培养过夜，获得基因工程菌株；3)将基因工程菌株，接种于LB培养基中诱导培养，此菌株经荧光抗体标记后，用流氏细胞术分析不同的信号肽和带电...

【技术特征摘要】
1.一种通过表面展示实现人源精氨酸酶-1固定化的方法，其特征在于：
1)首先，设计PCR引物分别携带编码信号肽Sec、Tat，带电荷多肽6×Lys、6×Glu、6×Asp和标签蛋白HA的序列，通过PCR将其分别融合在冰核形成蛋白剪切变体(InaK-N)的氨基端，和人源精氨酸酶-1的羧基端，然后将两类基因片段通过PCR融合在一起，构建出含有各种含有冰核形成蛋白和精氨酸酶重组表达质粒；
2)将构建好的重组质粒转化大肠杆菌表达菌株RosettaBlue感受态细胞，37℃静置培养过夜，获得基因工程菌株；
3)将基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：张贞，易犁，马立新，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42