重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及活性鉴定方法，该诱导表达以及纯化方法包括：1)重组表达质粒的构建：设计带有EcoR I和Not I酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增获得目的基因片段；2)筛选高抗性重组基因工程菌株；3)重组luansin多肽的发酵生产；4)重组luansin多肽的分离纯化：得到纯度为93％的重组lunasin多肽。本发明专利技术首次提出使用毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽，通过基因工程的方法使luansin多肽的规模化生产可以得以实现。毕赤酵母表达lunasin多肽成本低，产量高，分立纯化步骤简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及一种在毕赤酵母表达系统制备lunasin多肽的方法，具体为重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达、纯化以及生理活性鉴定方法。
技术介绍
Lunasin是一种含有43个氨基酸的新型多肽，首次从大豆种子中分离鉴定。研究表明lunasin具有很多特别的生理活性，包括抗癌和抗炎等。除此以外，专利201510224932.9公开了lunasin能够通过PPAR通路抑制小鼠前体脂肪细胞(3T3-L1)分化而具备潜在的减肥活性。然而，在天然作物中，Lunasin的含量较低，从中分离纯化Lunasin步骤繁琐，且得率较低，这使得大多关于Lunasin活性的研究都以昂贵的合成Lunasin为原料而限制其进一步研究及应用。目前，国内尚无关于如何利用基因工程方法，将Lunasin基因片段克隆转载到毕赤酵母中，经过诱导表达和纯化步骤生产出高活性真核表达Lunasin的报到。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种重组lunasi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)重组表达质粒的构建设计带有EcoR I和Not I酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，进行PCR扩增获得目的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶EcoR I酶和Not I酶进行双酶切，然后将用相同限制性内切酶EcoR I和Not I双酶切的质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶连接，通过热激转化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K‑lunasin；2)筛选高抗性重组基因工程菌株将重组表达质粒pPIC9K‑lunasin经Sac I线性...

【技术特征摘要】
1.一种重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及纯化方法，其特征
在于，所述方法包括以下步骤：
1)重组表达质粒的构建
设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin序列，并设计特异性扩增引物，
进行PCR扩增获得目的基因片段，将目的基因片段用限制性内切酶EcoRI酶
和NotI酶进行双酶切，然后将用相同限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切的
质粒pPIC9K与酶切后的PCR扩增产物用T4DNA连接酶连接，通过热激转
化到大肠杆菌DH5α中培养扩增，提取得到重组表达质粒pPIC9K-lunasin；
2)筛选高抗性重组基因工程菌株
将重组表达质粒pPIC9K-lunasin经SacI线性化酶切，将经酶切线性化的
重组表达质粒与感受态毕赤酵母GS115细胞按比例混合后，进行电击转化获
得转化子，将转化子分别接种于MM培养基和MD培养基，经过PCR鉴定及
G418高抗性筛选，阳性克隆为重组工程菌GS115/pPIC9K-lunasin；
3)重组luansin多肽的发酵生产
将上述获得的G418高抗性的阳性克隆重组工程菌株
GS115/pPIC9K-lunasin接种于BMGY培养基中，在30℃下培养直至OD600为
2.0-4.0，离心收集细胞，然后将细胞重悬于BMMY培养基中培养直至OD600为1.0-2.0，0.5％甲醇诱导表达；经甲醇诱导重组lunasin多肽的发酵液高速离
心除去细胞后，上清液使用Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，以筛选得到高
表达lunasin多肽的基因工程菌株；
4)重组luansin多肽的分离纯化
将上述筛选得到的高表达重组工程菌株再次发酵生产，得到的发酵液经
高速离心除去菌体后，上清中加入CaCl2溶液，充分混匀后室温静置5min，
高速离心得到沉淀，该沉淀经真空冷冻干燥得重组lunasin多肽粗产物；
将粗产物以浓度为10mg/mL溶解，使用DEAE阴离子交换柱，根据出峰
时间分部分收集洗脱液，真空干燥后，经Trish-TricineSDS-PAGE蛋白电泳，
收集lunasin多肽富集洗脱液，合并后过超滤膜浓缩液。浓缩液经真空冷冻干
燥后得到纯度为93％的重组lunasin多肽。
2.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及
纯化方法，其特征在于，步骤1)中设计带有EcoRI和NotI酶切位点Lunasin
序列为：
GAATTCTCCAAATGGCAGCACCAGCAAGACAGCTGCCGC
AAGCAGCTCCAGGGGGTGAACCTCACGCCTTGCGAGAAGCAC
ATCATGGAGAAGATCCAAGGCCGCGGCGATGACGATGATGAT
GATGACGACGACGCGGCCCTACTACTACTGCTGCTGCGCCGG。
3.根据权利要求1所述的重组lunasin多肽在毕赤酵母中的诱导表达以及
纯化方法，其特征在于，步骤1)中特异性扩增引物为：
上游引物：5’-GGAATTCTCCAAATGGCAGCAC-3’，
下游引物：5’-TTGGCCGCGTCGTCGTCATCATC-3’。
4.根据权利要求1所述的重...

【专利技术属性】
技术研发人员：任贵兴，朱莹莹，顿宝庆，么杨，王智，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11