一株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种生产α‑酮基丁酸的基因工程菌及其构建方法和应用，利用该菌株发酵生产α‑酮基丁酸具有较高的生产效率，属于生物技术领域。所述基因工程菌是对大肠杆菌Escherichia coli MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL。使用该菌采用发酵法生产α‑酮基丁酸能够克服化学合成法、酶法或微生物转化法存在的反应条件复杂、能耗大、污染重或生产成本高污染大等不足，在发酵20‑24h后，α‑酮基丁酸产量达到8.5‑15.7g/L，该发酵过程为好氧发酵，菌体生长快，发酵周期短，产酸速率高，目前未见直接发酵法生产α‑酮基丁酸的报道。

A gene engineering bacterium producing alpha keto butyric acid and application thereof

Gene engineering bacteria of the invention relates to a method for producing alpha keto butyrate and its construction method and application, using the fermentation production of alpha keto butyrate has high production efficiency, which belongs to the field of biotechnology. The gene engineering bacteria is obtained by genetically engineered strains of Escherichia coli Escherichia coli MG1655; the transformation of gene engineering for threonine dehydratase encoding gene ilvA, knockout acetohydroxyacid synthase I subunit encoding gene ilvB, acetohydroxyacid synthase III subunit encoding gene ilvI and threonine operon the leader peptide encoding gene thrL. The use of the bacteria produced by fermentation using alpha keto butyrate can overcome the shortage of chemical synthesis and reaction conditions for the existence of enzymatic or microbial transformation method of complex, high energy consumption, heavy pollution and high production cost of pollution. In 20 24h after fermentation, alpha keto butyrate production reached 8.5 15.7g/L, the fermentation the process for aerobic fermentation, the cell growth rate, short fermentation cycle, acid production rate is high, there is no direct fermentation of alpha keto butyrate reported.

【技术实现步骤摘要】
一株产α-酮基丁酸的基因工程菌及其应用
：本专利技术涉及一种生产α-酮基丁酸的基因工程菌及其构建方法和应用，利用该菌株发酵生产α-酮基丁酸具有较高的生产效率，属于生物

技术介绍
：α-酮基丁酸（α-ketobutyricacid），又称2-氧代丁酸（2-Oxobutyricacid）、2-酮基丁酸（2-Ketobutyricacid）等，是合成多种重要化学物质的中间体，被广泛用于医药、食品、化学等领域。如α-酮基丁酸可用于合成L-异亮氨酸、食品香料、1-丙醇、呋喃酮、保洛霉素、L-α-氨基丁酸以及D-α-羟基丁酸等物质。其中L-α-氨基丁酸是合成左乙拉西坦等抗癫痫药物的前体物，D-α-羟基丁酸是用来制备azinothricin家族抗癌药物。目前α-酮基丁酸的生产方法包括化学合成法和生物合成法。前者可由丙酸乙酯和草酸二乙酯水解获得α-酮基丁酸。而迄今报道的生物法合成α-酮基丁酸主要包括酶法和微生物转化法。Nakahara等（1994）以1，2-丁二醇为碳源和底物，采用马红球菌(Rhodococcusequi)IF03730将其转化为α-酮基丁酸，培养32h转化率为68.2%。随后研究发现恶臭假单胞菌(Pseudomonassputita)和施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)SDM分别能将巴豆酸和DL-2-羟基丁酸转化为α-酮基丁酸，其产量为4.8g/L。祖尔布里根(2005,CN159278)采用一株粗糙脉胞菌的Ilv-3突变体以L-苏氨酸为底物发酵生产α-酮基丁酸，在优化条件下产量达8g/L。马翠卿等（2011）报道了以L-苏氨酸为底物利用含L-苏氨酸脱水酶的施氏假单胞菌SDM细胞为生物催化剂制备α-酮基丁酸的方法，反应20h转化率为49.9%。尽管目前工业生产α-酮基丁酸主要采用化学合成法，但该方法存在反应条件复杂、能耗大、污染重等不足。而酶法或微生物转化法存在着底物生产成本高污染大、难以实现大规模生产等不足。若能采用微生物发酵直接生产α-酮基丁酸，则可以解决上述问题和不足。L-苏氨酸是合成α-酮基丁酸的前体物质，因此获得能够积累L-苏氨酸的菌株是发酵法生产α-酮基丁酸的必要前提。本专利技术中通过敲除苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL，以解除ThrL对L-苏氨酸合成途径中的关键酶编码基因(thrA、thrB、thrC)转录的弱化作用，达到增加L-苏氨酸合成的目的。α-酮基丁酸可被乙酰羟基酸合成酶进一步代谢生成2-乙酰基-2-羟基丁酸，而大肠杆菌中共含3个乙酰羟基酸合成酶，分别为乙酰羟基酸合成酶Ⅰ（由ilvBN基因编码）、乙酰羟基酸合成酶Ⅱ（由ilvGM基因编码）以及乙酰羟基酸合成酶Ⅲ（由ilvIH基因编码）。本专利中所用出发菌株大肠杆菌（Escherichiacoli）MG1655的乙酰羟基酸合成酶Ⅱ大亚基编码基因ilvG因移码突变而不表达，故只需敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ和乙酰羟基酸合成酶Ⅲ编码基因即可阻止α-酮基丁酸的进一步代谢。综上所述，本专利通过增强α-酮基丁酸合成代谢流并阻断其进一步代谢途径实现发酵法生产α-酮基丁酸，不但能够达到减轻污染、降低成本的目的，还能缓解L-苏氨酸产能过剩的压力。然而，目前该方法还未见报道。
技术实现思路
：本专利技术要解决的问题是克服化学合成法、酶法或微生物转化法存在的反应条件复杂、能耗大、污染重或生产成本高污染大等不足，提供一种产α-酮基丁酸的基因工程菌及采用该菌发酵生产α-酮基丁酸的方法。本专利技术解决上述技术问题采用的技术方案之一是：提供一种生产α-酮基丁酸的大肠杆菌基因工程菌，所述大肠杆菌基因工程菌是在大肠杆菌（Escherichiacoli）MG1655(ATCC47076)中过表达来自该菌的苏氨酸脱水酶编码基因ilvA、敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI及以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL所获得的突变株。所述编码基因ilvA的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO：1；所述编码基因ilvB的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO：2；所述编码基因ilvI的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO：3；所述编码基因thrL的核苷酸序列为序列表中的SEQIDNO：4；本专利技术解决上述技术问题的技术方案之二是：提供一种构建上述基因工程菌的方法，包括如下步骤：（一）ilvB基因的敲除1、采用PCR技术以大肠杆菌MG1655为模板，根据MG1655中ilvB(GeneID:948181)基因5’和3’端400bp序列设计同源臂引物，扩增获取ilvB基因的上下游同源臂。2、采用PCR技术以pKD3质粒为模板，设计引物，扩增氯霉素抗性基因盒片段。3、以1、2获得的扩增片段为模板通过重叠PCR获得ilvB基因敲除片段，所述基因敲除片段由乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB的上、下游同源臂基因片段以及氯霉素抗性基因盒片段组成。4、将上述基因敲除片段导入含pKD46质粒的大肠杆菌MG1655感受态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB基因敲除菌。（二）ilvI基因的敲除1、以步骤（一）中1-3相同的的方法构建ilvI(GeneID:947267)基因敲除片段。2、将（二）-1中的基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ilvB基因敲除菌感受态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB、ilvI基因敲除菌。（三）thrL基因的敲除1、以步骤（一）中1-3相同的的方法构建thrL(GeneID:948283)基敲除片段。2、将（三）-1中的基因敲除片段导入含有pKD46质粒的ilvB、ilvI基因敲除菌感受态细胞中获得阳性转化子，消除阳性转化子中的氯霉素抗性基因后获得ilvB、ilvI、thrL基因敲除菌THRZ。（四）ilvA基因的过表达1、将ilvA基因及其表达载体pWSK29用XbaI和BamHI进行双酶切后连接，连接产物转化至上述THRZ基因敲除菌中，通过菌落PCR鉴定获得的阳性转化子即为本专利技术所述的大肠杆菌基因工程菌。本专利技术解决上述问题所采用的技术方案之三是：提供一种发酵生产α-酮基丁酸的方法，包括以下步骤：①种子培养：将本专利技术所述的大肠杆菌基因工程菌经活化后接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25%(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30-50%，通风量3-5m3/h，搅拌转速200-600rpm，32-37℃培养6-8h。②发酵罐发酵：以5%-10%接种量将步骤①的种子培养物接至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-60%，流加浓度为60-80%(W/V)的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5%(W/V)，流加25%(W/V)的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期20-24h。③发酵液中α-酮基丁酸的检测：发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，采用UltiMate3000(ThermoScientific)高效液相色谱仪测定α-酮基丁酸的含量。检测条件为：色谱柱REzexR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因工程菌在发酵生产α‑酮基丁酸中的应用，其特征在于，所述基因工程菌，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，并敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI及以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL；所述应用包括以下步骤：①种子培养：将所述的基因工程菌经活化后接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8‑7.2，溶氧维持在30‑50％，通风量3‑5m

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌在发酵生产α-酮基丁酸中的应用，其特征在于，所述基因工程菌，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，并敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI及以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL；所述应用包括以下步骤：①种子培养：将所述的基因工程菌经活化后接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30-50％，通风量3-5m3/h，搅拌转速200-600rpm，32-37℃培养6-8h；②发酵罐发酵：以5％-10％接种量将步骤①的种子培养物接至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-60％，流加浓度为60-80％的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％(W/V)，流加25％的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，发酵周期20-24h；③发酵液中α-酮基丁酸的检测：发酵液经8000×g离心10min后取上清液并用去离子水稀释5倍后，采用UltiMate3000ThermoScientific高效液相色谱仪测定α-酮基丁酸的含量；检测条件为：色谱柱REzexRoA-organicAcidH+，流动相5mmol/LH2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，检测波长215nm，进样量为20μL；所述种子培养基成分为：蔗糖15-25g/L，玉米浆15-25mL/L，酵母粉1-4g/L，(NH4)2SO41-4g/L，KH2PO40.5-1.5g/L，MgSO40.1-0.5g/L，FeSO4·7H2O0.01-0.05g/L，MnSO4·H2O0.010.05g/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min；所述发酵培养基成分为：葡萄糖15-45g/L，酵母粉1-2g/L，豆饼水解液5-15mL/L，玉米浆5-15mL/L，KH2PO41-5g/L，柠檬酸0.5-2g/L，MgSO40.5-1g/L，FeSO4·7H2O0.1-0.5g/L，MnSO4·H2O0.1-0.5g/L，pH7.0，0.075MPa高压蒸汽灭菌15min。2.一种基因工程菌，是对出发菌株大肠杆菌(Escherichiacoli)MG1655进行基因工程改造获得的菌；所述基因工程改造为过表达苏氨酸脱水酶编码基因ilvA，并敲除乙酰羟基酸合成酶Ⅰ大亚基编码基因ilvB、乙酰羟基酸合成酶Ⅲ大亚基编码基因ilvI及以及苏氨酸操纵子前导肽编码基因thrL；所述的基因工程菌发酵生产α-酮基丁酸的方法，步骤如下：(1)种子培养：将所述的基因工程菌活化后，接种至装有1L种子培养基的5L发酵罐，流加25％W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30-50％，通风量3-5m3/h，搅拌转速200-600rpm，32-37℃培养6-8h；(2)发酵罐发酵：以5％-10％接种量将步骤(1)的种子培养物接至装有6L发酵培养基的10L发酵罐进行发酵培养，发酵温度32-37℃，通风量3-5m3/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-60％，流加浓度为60-80％W/V的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈宁，张成林，谢希贤，徐庆阳，刘淑云，刘远，刘宏亮，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12