本发明专利技术涉及用于在植物中表达重组人血白蛋白基因的农杆菌菌株。它解决了目前重组人血白蛋白不适合用微生物和动物为反应器进行产业化生产的问题。重组人血白蛋白转基因工程菌株为含有重组人血白蛋白基因质粒的农杆菌，表达出的蛋白质为人血白蛋白，菌株中所含有的重组人血白蛋白基因序列为在启动密码子前插入了Kozak序列的人血白蛋白开放阅读框碱基“基本序列”，或在此基础上在N端起始密码子后插入编码6个重复组氨酸的序列（6xHis），6xHis与白蛋白序列之间由编码肠激酶底物的序列连接的“改进序列”。本发明专利技术重组人血白蛋白转基因工程菌株可用于利用转基因植物规模化生产基因重组人血白蛋白。
【技术实现步骤摘要】
技术邻域本专利技术涉及一种用于在植物中表达重组人血白蛋白基因的农杆菌菌株，用于利用植物表达和制备重组人血白蛋白。农杆菌中的转化质粒包含白蛋白基本序列或在N末端连有组蛋白标签和肠激酶底物序列的改进序列。
技术介绍
人血白蛋白（human serum albumin，HSA）是由585个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子质量为66.5kD，等电点在4.7-4.9之间。它是人血液中的主要蛋白质，占血浆总蛋白的60%左右，每升人血中含有人血白蛋白约40g。除了血浆之外，人血白蛋白还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中。HSA前体（preproHSA）在肝脏中合成，并且在高尔基体中被加工剪切，形成成熟的HSA分子，释放到血液中，对保持血液的正常渗透压具有重要作用；它在血液中作为多种疏水性分子的载体，其中包括脂肪酸、胆色素、激素、生物学活性物质及药物等，从而调节人体内的多种生理功能。在体外，它作为多种药物的稳定剂被广泛用于多种疾病的治疗、药物载体、动物细胞培养、血浆替代物等。目前，临床使用的人血白蛋白主要是从人源血浆中提取和分离制得。然而，血浆来源受到限制，即有限的血液来源难以满足生产HSA和其相关制剂的需求。另一方面血液自身也可能含有危险的传染病原体如肝炎病毒、HIV病毒等，使得人们对于使用血浆中提取的人血白蛋白存在巨大的担忧。随着基因工程和分子生物学的发展，人们已经试图利用各种不同的表达系统来大批量生产重组人血白蛋白，但利用微生物和动物为反应器生产重组人血白蛋白等方法因表达后期的加工水平差异及表达水平较低或生产成本较高，不能用于工业化生产。所以，人血白蛋白不适合用微生物和动物为反应器进行产业化生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决目前人血白蛋白不适合用微生物和动物为反应器进行产业化生产的问题，提供两种重组人血白蛋白基因序列及其转基因工程菌株。重组人血白蛋白转基因工程菌为含有重组人血白蛋白基因质粒的农杆菌，其中质粒中重组人血白蛋白基因如“基本序列”或“改进序列”所示。本专利技术重组人血白蛋白转基因工程菌株为革兰式阴性菌，无芽孢短杆菌，菌宽为0.6-1.0 μm、菌长为1.5-3.0 μm，好气性，代谢为呼吸型，最适生长温度为28℃，最适酸碱度为pH6.0；菌落通常为圆形、隆起、光滑、白色至灰白色，半透明，具有利福平抗性和卡那霉素抗性。本专利技术重组人血白蛋白转基因序列中，为了增强目的基因的表达效果，重组人血白蛋白基因前设计了一个Kozak序列；为了在表达后便于纯化目的蛋白，在其中一种重组人血白蛋白基因序列前设计一个6×His标签。本专利技术重组人血白蛋白转基因工程菌株可用于介导植物。用转基因工程菌株介导植物，以植物为反应器进行大规模、产业化生产具有以下优点：（1）植物与动物同为真核生物，具有比较高级的真核蛋白合成途径，从而能够成功的进行转录后的修饰与加工，克服了微生物反应器不能完整的表达功能性蛋白的缺陷；（2）外源蛋白在植物中可以积累到较高水平，并且植物中表达的蛋白在功能上与动物自身生产的蛋白相同，可见转基因植物具有作为生物反应器生产蛋白、疫苗、抗体、细胞因子的能力；（3）植物病原菌不会对人或动物构成威胁，所以避免了动物表达系统的产品有被病原菌污染的可能，所以以植物作为生物反应器生产人血白蛋白更为安全；④以植物作为生物反应器易于规模化生产，与其它生物反应器相比较，植物的种植更加低廉。植物可以大规模种植和收获，表达的产物可以贮藏在根茎、种子、叶子或果实中便于贮藏和运输。筛选得到的纯系转基因植株，目的基因可以稳定遗传，大大降低了生产成本。附图说明图1.重组人血白蛋白转基因工程菌（表达“基本序列”）菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。M为分子标记（5000 bp），泳道1为阳性对照，泳道2-9为8个单菌落作模板的PCR产物（1785 bp），C为空白对照。图2.重组人血白蛋白转基因工程菌（表达“改进序列”）菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果。M为分子标记（5000 bp），泳道1-8为8个单菌落作模板的PCR产物（1824 bp），泳道9为阳性对照，C为空白对照。图3.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“基本序列”第294位至第1位核苷酸酸的反向测序结果图。图4.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“基本序列”第594位至第295位核苷酸的反向测序结果图。图5.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“基本序列”第595位至第894位核苷酸的正向测序结果图。图6.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“基本序列”第895位至第1194位核苷酸的正向测序结果图。图7.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“基本序列”第1195位至第1494位核苷酸的正向测序结果图。图8.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“基本序列”第1495位至第1767位核苷酸的正向测序结果图。图9.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“改进序列”第338位至第1位核苷酸的反向测序结果图。图10.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“改进序列”第638位至第339位核苷酸的反向测序结果图。图11.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“改进序列”第639位至第938位核苷酸的正向测序结果图。图12.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“改进序列”第939位至第1238位核苷酸的正向测序结果图。图13.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“改进序列”第1239位至第1538位核苷酸的正向测序结果图。图14.农杆菌中转化质粒编码人血白蛋白的DNA“改进序列”第1539位至第1800位核苷酸的正向测序结果图。具体实施方式本专利技术技术方案不局限于以下所列举的具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。具体实施方式一：本实施方式重组人血白蛋白转基因“基本序列”如下：GCCACCATGGATGCACACAAGAGTGAGGTTGCTCATCGGTTTAAAGATTTGGGAGAAGAAAATTTCAAAGCTTTGGTGTTGATTGCCTTTGCTCAGTATCTTCAGCAGTGTCCATTTGAAGATCATGTAAAATTAGTGAATGAAGTAACTGAATTTGCAAAAACATGTGTTGCTGATGAGTCAGCTGAAAATTGTGACAAATCACTTCATACCCTTTTTGGAGACAAATTATGCACAGTTGCAACTCTTCGTGAAACCTATGGTGAAATGGCTGACTGCTGTGCAAAACAAGAACCTGAGAGAAATGAATGCTTCTTGCAACACAAAGATGACAACCCAAACCTCCCCCGATTGGTGAGACCAGAGGTTGATGTGATGTGCACTGCTTTTCATGACAATGAAGAGACATTTTTGAAAAAATACTTATATGAAATTGCCAGAAGACATCCTTACTTTTATGCCCCGGAACTCCTTTTCTTTGCTAAAAGGTATAAAGCTGCTTTTACAGAATGTTGCCAAGCTGCTGATAAAGCTGCCTGCCTGTTGCCAAAGCTCGATGAACTTCGGGATGAAGGGAAGGCTTCGTCTGCCAAACAGAGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
转基因农杆菌菌株，含有表达人血白蛋白的外源质粒，表达出的人血白蛋白氨基酸序列如序列表所示。
【技术特征摘要】
1.转基因农杆菌菌株，含有表达人血白蛋白的外源质粒，表达出的人血白蛋白氨基酸序列如序列表所示。2.重组人血白蛋白转基因DNA序列，其特征在于重组人血白蛋白转基因“基本序列”或在基本序列基础上在白蛋白N末端加上了组蛋白标签及肠激酶底物序列的“改进序列”；“基本序列”或“改进序列”如序列表所示。3.重组人血白蛋白转基因工程菌株，其特征在于重组人血白蛋白转基因工程菌株为含有重组人血白蛋白基因质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：王大勇，陈林涛，韦双双，
申请(专利权)人：王大勇，
类型：发明
国别省市：海南;46
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