一种小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法及其应用，以小麦成熟花粉细胞为转化受体，通过对电击液、萌发液电击条件的筛选和优化，以提高小麦成熟花粉细胞的活力和体外萌发率，利用电击转化法对与干旱、高盐和低温的诱导表达相关的转录因子基因进行转化，获得转基因植株。本发明专利技术与农杆菌转化法和基因枪转化法等目前主要转基因方法相比，花粉电击转化法具有操作简洁、成本较低、省去了组织培养的过程、避免了再生性不强和容易产生嵌合体的问题，而且受体也没有基因型限制，转化植株后代稳定纯合迅速等优点，不需要进行组织培养中的抗性筛选过程，可以获得无筛选标记的安全转基因植株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程育种
，尤其涉及一种小麦花粉细胞电击法转化体系 的优化方法，及利用这一方法在获得抗逆转基因小麦上的应用。
技术介绍
小麦是主要的粮食作物之一，其总产量仅在玉米之下。到目前为止，我国培育小麦 新品种主要是通过常规杂交育种的方法。但这种方法周期较长、可选择范围比较窄，而且其 预见性比较差、性状改良的效率也较低，因而延缓了小麦育种的发展进程。 与常规育种相比，分子育种缩短了育种的年限，为不同物种之间的遗传交流提供 了可能，弥补了常规育种的不足，得到了广泛的利用和关注。随着植物遗传转化技术的日益 完善，利用转基因技术有目的、精确的改良植物遗传性状创制转基因新材料新品系已成为 目前小麦育种的新方向。同时随着小麦基因组测序工作的完成，大量基因将被克隆和进行 功能研究。转基因小麦研发和小麦功能基因组学研究需要获得大量转基因植株，迫切需要 提高小麦转化效率，扩大转化规模，建立高效、安全、规模化转基因技术体系，推进转基因小 麦产业化和小麦功能基因组学研究进程(叶兴国等2014)。 普通小麦(Triticum aestivum L.)为六倍体植物基因组庞大，在主要农作物中， 小麦属于遗传转化比较困难的作物，转化效率较低，重复性较差，转化规模较小，优良转基 因材料较少，基因工程育种进程明显落后于大豆、玉米、棉花、水稻等作物(叶兴国等2014)。 目前，应用于小麦的转基因技术主要包括基因枪介导法和农杆菌介导法，有些实验室也采 用花粉管通道、离子介导、激光微束穿刺、PEG、花粉介导和农杆菌浸花等方法（叶兴国等 2014)。其中基因枪转化法是小麦遗传转化中采用的最主要的转化方法，绝大多数的转化事 件是由基因枪法转化得到的。但基因枪转化法依赖于组织培养再生途径，组培程序复杂，材 料的无菌转接操作繁琐，转化过程对操作人员的操作技术水平要求较严;许多优良基因型 再生困难;且基因枪法成本较高；转化效率低而不稳，转化效率一般在0~1 % (叶兴国等 2011,2014);转化的外源基因拷贝数较多，易引起基因表达沉默;经过组织培养易产生无性 系变异;而且再生植株有嵌合体现象;转基因后代多为杂合状态，纯合时间较长，在自交纯 合过程中外源基因易丢失。农杆菌转化法也需要通过组织培养途径，成本较低且在双子叶 植物上已基本成熟，在单子叶植物小麦上随着不断地改进近年也有所进展，但在实际应用 中仍存在小麦愈伤组织对农杆菌不敏感、侵染后愈伤组织极易褐化死亡，往往导致转化失 败(叶兴国等2011;张洁等2013)。花粉管通道法是利用植物自然授粉过程中花粉管伸入到 子房中形成的花粉管通道，外源基因借助此通道进入胚囊，整合入受体植物基因组中完成 转基因过程。花粉管通道法不需要通过组织培养途径，也是借助自然授粉受精过程进行基 因转化，成本低、不受植物种类限制，但是重复性和稳定性较差，现有报道其转化率为 0.135% (张立等2013)，转化效率较低也不稳定。而其他的一些转化方法如显微操作、离子 束介导法在小麦上目前应用也较为困难，效率低下，在小麦未见有成功的报道。超声波花粉 介导法是利用超声波多次瞬时处理花粉导入外源基因，再通过授粉获得转基因植株，在油 菜、玉米、芥菜等作物上已有转化成功的报道，但在小麦转基因中未见报道。 小麦的遗传转化难度大、效率低，已成为目前制约小麦转基因研究发展的重要限 制因素。因此，研究探索一种不依赖组织培养途径、操作简单、成本低、高效稳定的小麦遗传 转化方法，对促进小麦转基因研究具有重要的意义。 电击法是将细胞置于高电场、低电容的环境中，利用高圧直流电给予细胞瞬时脉 冲(微秒-毫秒），使细胞膜瞬间被击穿，产生微小孔洞，细胞膜出现通透性，引起一些分子、 离子的运动与流动压迫细胞膜，使其通透性增加，外源大分子或DNA的片段由这些孔洞进入 细胞中（张有明等2004)。在适当的电场强度下，电击后细胞膜上形成的孔洞是可逆的（张小 娟等2011)，当外加电场消失后，被击穿的细胞膜的脂质和蛋白质分子在维持极短时间后， 可以重新排列恢复到原来的结构，细胞仍保持活力，外源遗传物质随着细胞的生长分化整 合进受体细胞基因组。 电击法操作简单、迅速，省时省事，在植物中一般常用于原生质体的转化。但植物 原生质体分离培养复杂，再生困难，使其应用于转化的瓶颈，也有利用幼胚、合子等为受体 进行的电击转化(王胜华等2001 ;Wang LP等2003)，但都需要经历繁琐的组织培养过程。小 孢子、花粉和合子细胞同时具有单倍体和单细胞的特点，理论上单倍体、单细胞是转基因最 为理想的受体细胞，相对于二倍体细胞来说，单倍体细胞只有一套染色体，只要转入外源基 因就可以通过染色体加倍的方式来得到纯合体，转基因植株在后代自交的过程中便可以避 免或者减少所转化的目的基因的丢失，从而提高了转化效率，后代植株的纯合性和稳定性 也比较好，而且缩短了得到转基因植株的年限;而以单细胞为受体转化成功后，起源于单细 胞的转化植株无嵌合体现象，后代稳定快，外源基因不易丢失。因此小孢子、花粉细胞和合 子细胞是转基因最为理想的受体细胞，但小麦小孢子培养技术复杂、再生也较难，合子细胞 数量少，分离和培养困难，在转化中难以应用。利用花粉为受体细胞结合杂交授粉过程进行 外用源基因的转化，可以避免繁琐复杂的组织培养过程，不会产生无性系变异和嵌合体，无 需进行转化过程中的抗性筛选，载体构建简单，可以获得无筛选标记基因的安全转基因植 株，是一种简单高效非常有前景的转化技术。自Matthews BF等（1990)利用电穿孔的方法将 外源基因转入花粉之后，人们开始在不同植物上利用花粉电穿孔转化法进行转基因研究。 先后烟草（Saunders JA等1992)、苦瓜（张有明2004)、玉米(王清岚2006)等植物上取得成 功，显示了这一技术的有效性，为进行小麦的花粉电击转化提供了依据。 花粉电击转化已有的报道均是在一花多实植物上取得的成功，小麦属于单子房单 胚珠作物，与一花多实植物相比杂交授粉速度较慢，但与小麦其他的转化方法相比，花粉电 穿孔转化法操作简单快速、成本低，不需要组织培养途径，省时省力，转基因后代纯合稳定 快，可以获得无筛选标记的转基因植株，而剔除筛选标记基因可以提高转基因作物的安全 性，减少对环境的潜在危险，并且加快转基因作物的商业化(张新梅等2004)。因此，探索并 建立小麦花粉电击转化法具有非常重要的意义和应用前景。 花粉电击转化中受到多种因素的影响，在我们前期实验中，对小麦花粉电击过程 中的电场强度、环境温度、花粉细胞密度和状态、授粉时间、DNA密度等关键影响因素进行了 比较试验，表明电穿孔转化时，电场强度为6kv/cm、DNA浓度为0.025ug/ul、电击1次、花粉密 度为5 X106个/mL、选开花当天即将萌发的花粉电击处理、冰上操作，以及去雄后第5天授粉 为最佳电击转化参数，通过对这些参数的优化，已经初步建立了小麦花粉电击转化技术体 系，并将⑶S基因转入小麦中，经检测鉴定⑶S基因稳定整合进小麦基因组并表达(张小红等 2013)。说明我们初步建立的小麦花粉电击转化法是可行的，但在转化过程中发现，由于电 击缓冲液中含糖量较高，授粉后子房部位霉变腐烂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法，其特征在于，所述小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法以小麦成熟花粉细胞为转化受体，通过对电击液、萌发液电击条件的筛选和优化，优化电击转化体系；利用电击转化法对与干旱高盐和低温等抗逆相关的转录因子基因DREB4A和W17进行转化，以获得转基因植株；所述小麦花粉细胞电击法转化体系的优化方法具体包括：从菌液中分别提取含DREB4A和W17基因的质粒；小麦花粉最适电击液的优化；电击后FDA染色和观察、统计；电击后花粉萌发液的优化处理；授粉及后处理；基因组DNA的提取；PCR检测转基因植株。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张小红，闵东红，邵景侠，黎飞飞，赵雪晶，邓艳芳，胡晓薇，田原，付金梅，乔梦，王晓东，普正菲，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61