一种开花提前的转基因植物的培育方法技术

本发明专利技术公开了一种开花提前的转基因植物的培育方法，属于分子生物学技术领域。本发明专利技术所公开的方法是将大豆的miRNA172a通过表达载体转移至农杆菌中，再通过农杆菌侵染宿主植株，通过靶基因降解位点的验证和筛选鉴定获得转基因阳性单株。本发明专利技术从大豆全基因组中克隆出miRNA172a基因，并通过构建表达载体将该基因转到拟南芥中成功获得转基因纯化植株及相应表型，能够有效提前拟南芥的开花时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于分子生物学

技术介绍
MicroRNAs(miRNAs)是一种基本的、具有序列特异性的真核基因组的调节因子，通 常在转录水平或者转录后水平调节其靶基因的表达。成熟的miRNAs是一系列小的非编码单 链小分子RNA，在动物中，它通常由20-22核苷酸组成，而在植物中通常是20-24个核苷酸大 小。MicroRNAsUiRNAs)在植物的生长发育以及植物对环境的适应方面发挥了重要的作用， 成为近几年研究的热点。 miR172最早在拟南芥中通过小RNA测序获得的，由于它极度保守，在多种植物中也 被相继发现。之前的大多数研究显示miR172通过抑制一系列AP2-like类转录因子参与植物 花器官的形成与开花时间调控。然而，到目前为止，对大豆miR172家族的研究相对较少，尚 没有以大豆miRl72基因培育转基因植物的方法。
技术实现思路
针对以上问题，本专利技术提供了，所采取的 技术方案如下： 本专利技术的目的在于提供，该方法的步骤如 下： 1)克隆待转基因的如体序列，并构建含有待转基因如体序列序列的表达载体； 2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌中，并利用所得农杆菌侵染宿主植物； 3)验证步骤1)中前体序列对靶基因的降解位点，并筛选鉴定步骤2)中被侵染的宿 主植物，获得转基因阳性单株； 4)通过表型验证转基因株系。 优选地，步骤1)所述前体序列，是含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，核苷 酸序列如SEQIDNO. 1所示;所述克隆所用引物的序列如SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示； 所述表达载体，还含有草丁膦抗性基因。 优选地，步骤1)所述表达载体，所用质粒PCAMBIA3301。优选地，步骤2)所述农杆菌，为农杆菌EHA105;所述宿主植物，为拟南芥。 优选地，步骤3)所述靶基因为基因Glyma03g33470。 更优选地，所述验证降解位点是验证miRNA172a对祀基因Glyma03g33470的降解位 点，是提取侵染宿主植物的总RNA合成cDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDN0.5和SEQID NO. 6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离，回收目的 DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定。优选地，所述测序鉴定，是分析确定降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5'-端第十和第^ 碱基之间。 优选地，所述靶基因，扩增靶基因所用引物的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8 所示。 所述培育方法的具体步骤如下： 1)以大豆基因组为模板，以如SEQIDN0.2和SEQIDN0.3所示的核苷酸序列为引 物，克隆如核苷酸序列如SEQIDN0.1所示含有大豆miRNA172a基因保守区域的序列，并利 用所得序列与草丁膦抗性基因、质粒PCAMBIA3301构建表达载体； 2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌EHA105中，再利用所得农杆菌侵染拟南 芥，获得侵染植物； 3)提取步骤2)侵染植物中的总RNA并合成CDNA，再利用核苷酸序列如SEQIDN0.5 和SEQIDNO.6所示的引物进行两轮巢式PCR，并通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离， 回收目的DNA片段后，再将回收产物连接到pGM-T载体上，转化到大肠杆菌后进行测序鉴定， 分析确定所转序列对祀基因Glyma03g33470的降解位点是否分布在侵染植物大豆gma-miR172a成熟序列5'-端第十和第^^一碱基之间，鉴定后通过草丁膦抗性筛选，PCR定量鉴 定，获得转基因阳性单株； 4)通过与野生型对比验证步骤3)所得转基因阳性单株的开花时间是否提前，获得 转基因株系。 以上所述培育方法在作物育种中的应用也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术获得的有益效果是： 本专利技术从大豆全基因组中克隆出miRNA172a(gma-miRNA172a)基因，并通过构建表 达载体将该基因转到拟南芥中成功获得转基因纯化植株及相应表型，该基因能够有效提前 拟南芥的开花时间。利用本专利技术所提供的培育方法能够培育出具有大豆miRNA172a基因的开花提前的 拟南芥植株系。利用本专利技术所提供方法培育出的转基因植株，其长、短日照条件下开花时间 比对照组分别提前了 4和9天。本专利技术所提供的方法一方面验证了大豆miRNA172a基因的促 进提前开花的作用，同时，本专利技术确定了大豆miRNA172a基因在大豆体内的靶基因。【附图说明】图1为利用DNAman软件对大豆miR172家族成员的前体序列进行比对的结果。 图2不同的生长天数、组织、光周期条件下的gma_miR172a和革E1基因Glyma03g33470 的表达情况；(其中，A为不同生长天数下不同miRNA172基因及靶基因Glyma03g33470的表达情 况;B为基因gma-miR172a和靶基因Glyma03g33470在植株不同部位的表达情况；C为大豆 miR172a的昼夜节律表达;D为大豆Glyma03g33470的昼夜节律表达）。 图3利用5'RACE实验探索大豆miR172a对靶基因Glyma03g33470降解位点的位置。图4为转基因植株的筛选鉴定结果； (其中，A为T2代转基因植物中目的基因的PCR鉴定，其中M:DL2000plusDNA分子量 标准；1-20 :PPT抗性干涉拟南芥；21:野生型拟南芥；22 :水；23 :阳性质粒；B为抽提gma-miR172a转基因T3代植株RNA)。图5以大豆miRNA172a的转基因拟南芥为实验组，野生型为对照组，比较转基因T3 代在长、短日照条件下的开花情况；(其中，A为不同日照条件下转基因植株的生长情况;B为不同日照条件下转基因植 株与对照植株的叶片生长情况;C为不同日照条件下转基因植株与对照植株的开花情况）。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规 材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。 实施例1大豆miRNA172a的克隆与表达载体构建 1.根据已知miRNA172a基因序列的保守区域，设计大豆miRNA172a引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3。对由组织抽提的大豆全基因组DNA进行特异性PCR扩增； 2.常温凝胶电泳分离产物，检测到大小约159bp的条带； 3.回收条带纯化，再次用同一引物扩增后测序，结果如SEQIDN0.1。 4.利用限制性内切酶Bgin、BstEII双酶切pCAMBIA3301质粒和pGM-T-miR172a质 粒，得到酶切片段；回收所得PCAMBIA3301酶切体系中的载体大片段和miR172a基因小片段， 利用T4DNA连接酶将miR172a基因替代原pCAMBIA3301质粒上的GUS基因，构建表达载体 pCAMBIA3301-miR172a;将得到的载体pCAMBIA3301-miR172a导入农杆菌EHA105,进行PCR检 测和酶切鉴定，用检测转化成功的农杆菌侵染植物，得到转基因植物。 实施例2大豆miR172成员序列分析与比对[0当前本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种开花提前的转基因植物的培育方法，其特征在于，步骤如下：1)克隆待转基因的前体序列，并构建含有待转基因前体序列序列的表达载体；2)将步骤1)构建的表达载体导入到农杆菌中，并利用所得农杆菌侵染宿主植物；3)验证步骤1)中前体序列对靶基因的降解位点，并筛选鉴定步骤2)中被侵染的宿主植物，获得转基因阳性单株；4)通过表型验证转基因株系。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李永光，李文滨，王涛，孙铭阳，王雪松，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23