根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法技术

本发明专利技术公开了一种根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于以荸荠秆枯病菌分生孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与荸荠秆枯病菌分生孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子，从而建立了荸荠秆枯病菌高效的遗传转化体系。该法操作简单、转化效率高且稳定性好，以此构建荸荠秆枯病菌突变体库，由农杆菌介导介导荸荠秆枯病菌的遗传转化获得的转化子可为筛选弱致病性和致病性缺陷的荸荠秆枯病菌菌株提供了丰富的筛选菌源，同时为克隆荸荠秆枯病菌致病性相关基因，深入研究荸荠秆枯病菌致病机理奠定基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物基因工程
，尤其涉及一种根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法。
技术介绍
荸荠(Eleocharis dulcis)属莎草科(Cyperaceae)荸荠属(Eleocharis)，是多年生草本植物，又名地栗、乌芋、马莽、红慈姑、马蹄等。原产于我国南方和印度，在我国有逾2000年的栽培历史。目前，荸荠广泛栽培于我国长江流域及其以南各省，广西则以合浦、桂林、贺州等地区广泛种植；在美国、朝鲜、越南、澳大利亚、日本等国亦有栽培。据不完全统计，1998年我国荸荠栽培面积约为3.5万hm2，年产75万t左右；2011年广西荸荠种植面积达2万hm2，总产量达60万t，面积和产量占全国的一半以上，荸荠产业收入达18亿元以上，主要供国内市场鲜销，仅部分加工成罐头或冷藏，经我国香港或台湾转销东南亚和欧美各国，并且出口量逐年增加，如美国1983～1987年4年间进口数量几乎增加了2.5倍。荸荠球茎营养丰富，汁多味甜，自古以来就有“地下雪梨”的美誉，北方人更将其视为“江南人参”。荸荠富含多种营养物质，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、粗纤维、胡萝卜素、维生素B1、B2、C、尼克酸和各种矿物质。荸荠既可生吃，亦可熟食，还可制成各种罐头、饮料。荸荠的地上茎秆和地下球茎均可入药，具有很好的医疗保健效果，如抗肿瘤作用、抗菌作用、治疗呼吸道疾病、利肠通便和利尿排淋作用、治疗糖尿病、清肺化痰。荸荠球茎表皮中含有丰富的棕色素，提取后可用做食品添加剂。另外，荸荠植株可以吸收湿地中放射性物质铀，对湿地铀污染有一定的净化作用。荸荠因其独特的营养价值和药用功效，现今已成为大众喜爱的季节性蔬菜。但是，荸荠在栽培过程中常受病害侵扰，其中以秆枯病(俗称“荸荠瘟”)发生最为严重。该病主要为害叶鞘、叶状茎、花器等部位，严重影响荸荠的产量和品质。该病病原为荸荠柱盘孢菌Cylindrosporium eleocharidis Lentz，属半知菌类黑盘孢目柱盘孢属。近几年来，随着荸养种植面积的扩大和连作，荸荠秆枯病也呈逐年上升趋势。发病年一般病秆率20％～50％，重病田块可达100％；球茎损失在45％以上，以至有的田块颗粒无收。尽管政府部门已对秆枯病予以高度重视，广大的科技人员也付出大量的心血研究控制措施，但由于致病机理尚不清楚，远不能达到有效地遏制该病蔓延和传播的要求。为了更好地防
治该病，对该病菌的致病分子机理进行深入研究具有重要意义。分离和鉴定荸荠秆枯病菌致病相关基因是关键所在，而建立真菌遗传转化技术创造致病性缺陷突变体则是分离和鉴定致病性相关基因的一种有效途径。目前，丝状真菌遗传转化技术已成为植物病原真菌分子遗传和基因功能研究的重要手段。由农杆菌介导的真菌遗传转化技术(ATMT)已经成功应用于U.maydis、Pseudozyma antarctica、U.hordei、S.scitamineum等黑粉菌及其它丝状真菌中。农杆菌介导的真菌转化相比其它几种真菌转化方法(PEG-MT、REMI、基因枪等)具有以下的优点：1)转化受体可以是多种类型，既可以是原生质体，又可以是菌丝、分生孢子，甚至蘑菇的菌丝体组织。因此，相比PEG-MT和REMI，利用ATMT转化可以省略原生质体制备的繁琐步骤，省力又省时。2)成本低，转化不需要复杂的仪器，任何实验室只要具有微生物培养的基本实验条件，都可以进行这种转化。3)转化效率较高，据报道同时用PEG和ATMT对Venturia inaequalis转化后发现，ATMT的转化效率要比PEG-MT的高出10倍。4)随机插入的T-DNA多为单拷贝。5)获得的转化子稳定，由ATMT得到的转化子，在没有选择压力的培养基上培养几代后也不会丧失抗生素抗性。迄今，未见荸荠秆枯病菌遗传转化体系相关报道，因此，建立荸荠秆枯病菌的遗传转化体系，应用于荸荠杆枯病菌致病相关基因的研究将有助于解析荸荠杆枯病菌的致病机制，对推动荸荠秆枯病菌分子生物学研究意义重大。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简单、转化效率高、稳定性好的根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，该法获得的转化子可为筛选弱致病性和致病性缺陷性突变体提供丰富的筛选菌源。为解决上述技术问题，本专利技术采用以下技术方案：根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，以荸荠秆枯病菌分生孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与荸荠秆枯病菌分生孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。荸荠秆枯病菌分生孢子按以下操作制备：在马铃薯-葡萄糖-琼脂培(PDA)养基上将荸荠秆枯病菌培养15-20天后，用灭菌的去离子水将荸荠秆枯病菌的分生孢子刮下，然后用无菌擦镜纸过滤去除菌丝，得到的荸荠秆枯病菌分生孢子滤液用去离子水调整到浓度为105-108孢子/毫升，获得荸荠秆枯病菌分生孢子悬浮液备用。含有双元载体的根癌农杆菌按以下操作准备：利用携带绿色荧光蛋白基因eGFP和潮霉素抗性筛选基因hpth的质粒pEV为转化载体，通过电击转化将质粒pEV载体转入农杆菌感受态细胞中；挑含有双元载体的根癌农杆菌菌体至5mL的MM液体培养液中，28℃，
200rpm，培养过夜，用IM液体培养液将菌液稀释OD600至0.15左右，28℃下预诱导培养6h，使菌液OD600调至为0.5备用。MM液体培养液为基本培养基，其配方为：1.45g KH2PO4，2.05g K2HPO4，0.5g NH4NO3，0.01g CaCl2，0.3g(NH4)SO4，2g Glucose，0.01g FeSO4，5ml Z-buffer，加双蒸水定容至1000mL，pH6.7-7.0；诱导培养基(induce media，IM)配方为：1g Glucose，7.808g MES，1.45g KH2PO4，0.5g NH4NO3，0.6g MgSO4·7H2O，0.01g CaCl2，0.3g NaCl，0.5g(NH4)SO4，HCl调pH值到5.6，双蒸水定容至1000mL。共培养按以下操作进行：分别取荸荠秆枯病菌分生孢子悬浮液和农杆菌培养液各100μL混合后涂板于含AS的覆盖有纤维素滤膜的IM固体培养基上，24℃下共培养48h-72h；IM固体培养基由每升诱导培养基(IM)加25克琼脂构成。抗生素筛选按以下操作进行：转移纤维素滤膜至含有潮霉素B和头孢噻肟钠的PDA，28℃下培养8-12d；将长出的单菌落转化子用牙签挑到含有潮霉素B的PDA上进行二次筛选，第二次筛选获得的抗潮霉素B的荸荠秆枯病菌即为转化子。为研究荸荠杆枯病菌的致病机制，专利技术人建立了一种根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于以荸荠秆枯病菌分生孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与荸荠秆枯病菌分生孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子，从而建立了荸荠秆枯病菌高效的遗传转化体系。该法操作简单、转化效率高且稳定性好，以此构建荸荠秆枯病菌突变体库，由农杆菌介导介导荸荠秆枯病菌的遗传转化获得的转化子可为筛选弱致病性和致病性缺陷的荸荠秆枯病菌菌株提供了丰富的筛选菌源，同时为克隆荸荠秆枯病菌致病性相关基因，深入研究荸荠秆枯病菌致病机理奠定基础。附图说明图1是荸荠秆枯病菌菌落和分生孢本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于以荸荠秆枯病菌分生孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与荸荠秆枯病菌分生孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。

【技术特征摘要】
1.一种根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于以荸荠秆枯病菌分生孢子为转化受体材料，将含有双元载体的根癌农杆菌与荸荠秆枯病菌分生孢子混合后共培养，用抗生素筛选，获得抗性转化子。2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于所述荸荠秆枯病菌分生孢子按以下操作制备：在马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基(PDA)上将荸荠秆枯病菌培养15-20天后，用灭菌的去离子水将荸荠秆枯病菌的分生孢子刮下，然后用无菌擦镜纸过滤去除菌丝，得到的荸荠秆枯病菌分生孢子滤液用去离子水调整到浓度为105-108孢子/毫升，获得荸荠秆枯病菌分生孢子悬浮液备用。3.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于所述含有双元载体的根癌农杆菌按以下操作准备：利用携带绿色荧光蛋白基因eGFP和潮霉素抗性筛选基因hpth的质粒pEV为转化载体，通过电击转化将质粒pEV载体转入农杆菌感受态细胞中；挑含有双元载体的根癌农杆菌菌体至5mL的MM液体培养液中，28℃，200rpm，培养过夜，用IM液体培养液将菌液稀释OD600至0.15左右，28℃下预诱导培养6h，使菌液OD600调至为0.5备用。4.根据权利要求3所述的根癌农杆菌介导的荸荠秆枯病菌的遗传转化方法，其特征在于所述MM液体培养液为基本培养基，其配方为：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜梅新，江文，欧昆鹏，桂杰，董伟清，高美萍，何芳练，张尚文，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45