本发明专利技术涉及启动子NtR2驱动AhRESS在本生烟草发状根产白藜芦醇方法，属于植物基因工程领域。利用发根农杆菌介导将烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS载体pBI121-NtR2-AhRESS遗传转化本生烟草，获得特异表达AhRESS的转基因本生烟草发状根。通过转基因本生烟草发状根的液体悬浮培养技术，建立了转基因本生烟草发状根的快速繁殖体系。利用有机溶剂浸提法提取转基因本生烟草发状根中白藜芦醇，经高效液相色谱（HPLC）测定，其白藜芦醇含量最高为1.59μg/g（FW），是未转基因发状根中白藜芦醇含量的3倍。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及启动子NtR2驱动AhRESS在本生烟草发状根产白藜芦醇方法，属于植物基因工程领域。技术背景白藜芦醇（Resveratrol，简称Res），是一种重要的植物抗毒素，存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，在葡萄果皮和花生根中含量尤为丰富。它具有多种生物活性，是一种天然的抗氧化剂，可以降低血脂，抑制血小板凝结，抗癌，抗炎，抗辐射，抗衰老，防治心血管疾病等。它与紫杉醇都被誉为绿色抗癌药物。但自然界中存在的白藜芦醇的含量较少，利用植物基因工程技术高效生产白藜芦醇是大量获得白藜芦醇的重要途径。白藜芦醇广泛存在于种子植物中，作为芪类次生代谢物，主要通过苯丙氨酸代谢途径合成的。刘蕾等克隆了白藜芦醇合酶cDNA，并将其转化花生的下胚轴、胡萝卜的下胚轴；同时，也把花生RESS转化酵母。许玉芬等成功构建了花生白藜芦醇合酶基因的酵母表达载体，并通过电穿孔法将其整合到毕赤酵母的染色体上；成功构建了由Ubi启动子驱动的花生白藜芦醇合酶基因单子叶植物表达载体，分别利用农杆菌介导和基因枪转化法转导甘蔗。黄国强等研究了白藜芦醇合酶基因在花生根中的特异表达，研究结果表明：该基因的转录表达在根的韧皮部，其他组织中未见表达；酵母浸提液处理可使该基因的转录表达明显增强。林荣华等以花生中的白藜芦醇合酶基因为目的基因，构建了含目的基因的植物重组表达载体pB6RS，利用电穿孔法将pB6RS质粒直接导入根癌农杆菌LBA4404中，通过农杆菌介导将pB6RS转化烟草（云烟85），得到了阳性植株。由于白藜芦醇的重要生理功能，近几年，人们开始研究利用生物技术提高植物材料中白藜芦醇的含量。Giovinazzo等研究者以35S启动子调控白藜芦醇合酶基因进行番茄遗传转化，测定转基因番茄中的抗坏血酸盐与谷胱甘肽还原酶的总体水平，结果表明：转基因植物的抗氧化性较之野生型植物的抗氧化性有了显著的提高。Hüsken等利用油菜种子特异表达启动子驱动白藜芦醇合酶基因表达，转化油菜，同时，阻断消耗白藜芦醇合酶底物的另一条支路，检测T0代油菜种籽中的Res含量，发现以鲜重计其最高含量为361μg/g，同时还获得了品质改善且保健性提高的油菜种籽。但目前，通过根特异启动子驱动白藜芦醇合酶基因表达生产白藜芦醇的研究未见报道。发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）是一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物，诱导植物产生发状根(毛状根)。发状根相对于正常的根，有很多优点。理论上，发状根来源于一个植物细胞，不是嵌合体，所以其遗传性状稳定，继代多次仍然具有原始发状根的遗传特性；发状根能够在无外源激素的培养基中自主生长，且生长速度快，易操作和调控，不受季节和地域限制；某些次生代谢产物在发状根中含量比正常根高。因此，利用发状根生产次生代谢产物是一条可靠和有效的途径。本专利技术针对以上研究背景，利用发根农杆菌介导pBI121-NtR2-AhRESS遗传转化本生烟草，获得根特异启动子NtR2驱动AhRESS表达的转基因本生烟草发状根，通过发状根液体悬浮培养技术，快速获得大量发状根，进而用于白藜芦醇的生产。该专利技术为利用烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS在本生烟草发状根中特异表达，进而生产白藜芦醇提供了良好的基础。
技术实现思路
本专利技术提供了启动子NtR2驱动AhRESS在本生烟草发状根产白藜芦醇方法。目的在于提供烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS在本生烟草发状根中特异表达，进而生产白藜芦醇的技术，以便利用植物基因工程手段高效生产白藜芦醇。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：启动子NtR2驱动AhRESS在本生烟草发状根产白藜芦醇方法，包括以下步骤：（1）克隆烟草根特异启动子NtR2和花生AhRESS基因；（2）烟草根特异启动子NtR2驱动花生AhRESS基因表达载体pBI121-NtR2-AhRESS的构建；（3）pBI121-NtR2-AhRESS经发根农杆菌介导转化本生烟草；（4）转pBI121-NtR2-AhRESS本生烟草发状根液体悬浮培养；（5）转pBI121-NtR2-AhRESS本生烟草发状根白藜芦醇含量的检测。所述步骤（1）中烟草根特异启动子NtR2的序列为SEQIDNo：1，花生白藜芦醇合酶基因AhRESS的序列为SEQIDNo：2。所述步骤（3）中发根农杆菌为印度国际半干旱热带作物研究所赠送的发根农杆菌，其介导的本生烟草遗传转化采用叶盘法。所述步骤（4）中转pBI121-NtR2-AhRESS本生烟草发状根液体悬浮培养所用培养基为MS培养基+500mg/LCef，第一次继代培养基为MS培养基+300mg/LCef，第二次继代培养基为MS培养基+100mg/LCef，第三次继代培养基为MS培养基。三次继代后头孢霉素浓度降至0。所述步骤（5）中转pBI121-NtR2-AhRESS本生烟草发状根白藜芦醇含量的检测方法为HPLC，色谱条件为：色谱柱ODS(250mm×4.6mm×5μm)，流动相乙腈：水（25:75），流速1.0mL/min，检测波长306nm，柱温25℃，进样量10μL。具体包括以下步骤：1.烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI121-NtR2-AhRESS的构建。（1）克隆烟草根特异启动子NtR2，并连接至pMD18-T载体中，得到pMD18-NtR2载体；（2）pBI121-NtR2-GUSA载体构建：利用限制性内切酶BamHⅠ及SacⅠ对pBI121质粒载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，利用带有限制性酶切位点的特异引物从pCAMBIA1301载体中克隆GUSA基因，连接至酶切后的pBI121载体上，得到pBI121-GUSA载体；将pBI121-GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将pMD18-NtR2载体进行酶切反应，将NtR2启动子连接至pBI121-GUSA载体中，得到pBI121-NtR2-GUSA载体；（3）pBI121-NtR2-AhRESS载体的构建：克隆花生白藜芦醇合酶基因AhRESS基因，并连接到pBI121-NtR2-GUSA载体中，得到pBI121-NtR2-AhRESS载体。烟草根特异启动子NtR2驱动花生白藜芦醇合酶基因AhRESS表达载体pBI121-NtR2-AhRESS经发根农杆菌介导转化本生烟草。在发根农杆菌诱导植物产生发状根的基础上，利用p本文档来自技高网...
【技术保护点】
启动子NtR2驱动AhRESS在本生烟草发状根产白藜芦醇方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）克隆烟草根特异启动子NtR2和花生AhRESS基因；（2）烟草根特异启动子NtR2驱动花生AhRESS基因表达载体pBI121‑NtR2‑AhRESS的构建；（3）pBI121‑NtR2‑AhRESS经发根农杆菌介导转化本生烟草；（4）转pBI121‑NtR2‑AhRESS本生烟草发状根液体悬浮培养；（5）转pBI121‑NtR2‑AhRESS本生烟草发状根白藜芦醇含量的检测。
【技术特征摘要】
1.启动子NtR2驱动AhRESS在本生烟草发状根产白藜芦醇方法，其特征在于：包括以下
步骤：
（1）克隆烟草根特异启动子NtR2和花生AhRESS基因；
（2）烟草根特异启动子NtR2驱动花生AhRESS基因表达载体pBI121-NtR2-AhRESS的构
建；
（3）pBI121-NtR2-AhRESS经发根农杆菌介导转化本生烟草；
（4）转pBI121-NtR2-AhRESS本生烟草发状根液体悬浮培养；
（5）转pBI121-NtR2-AhRESS本生烟草发状根白藜芦醇含量的检测。
2.根据权利要求1所述的启动子NtR2驱动AhRESS在本生烟草发状根产白藜芦醇方法，
其特征在于：所述步骤（1）中烟草根特异启动子NtR2的序列为SEQIDNo：1，花生AhRESS基
因的序列为SEQIDNo：2。
3.根据权利要求1所述的启动子NtR2驱动AhRESS在本生烟草发状根产白藜芦醇方法，
其特征在于：步骤（2）具体方法为：
1）将烟草根特异启动子NtR2连接至pMD18-T载体中，得到pMD18-NtR2载体；
2）pBI121-NtR2-GUSA载体构建：将pBI121载体进行酶切，切除该载体上的GUSA基因，从
pCAMBIA-1301载体中克隆GUSA基因连接至pBI121载体上，构建pBI121-GUSA；将pBI121-
GUSA载体进行酶切反应，切除35S启动子，将p...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓烨，庄伟建，马世伟，陈华，蔡铁城，张冲，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。