一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法技术

本发明专利技术公开了一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法。所述方法包括以下步骤：步骤(1)组织培养得到宽叶不死鸟幼苗；步骤(2)侵染和共培养；步骤(3)筛选和分离抗性苗共培养结束后，将叶片转接到筛选培养基上进行筛选培养；步骤(4)验证提取获得的抗性苗的叶片的DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳验证。本发明专利技术建立了稳定的宽叶不死鸟的转基因体系，为宽叶不死鸟的转基因育种提供了关键的技术支持，能够培育出具有高观赏价值的宽叶不死鸟新品种。本发明专利技术提供的农杆菌介导高效转染体系适合对宽叶不死鸟进行转基因功能验证、宽叶不死鸟突变体的获得、宽叶不死鸟转基因育种。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农杆菌介导
，尤其涉及一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法。
技术介绍
宽叶不死鸟(K.daigremontian)，又名大叶落地生根、花蝴蝶、倒吊莲、伤药、打不死、晒不死、古仔灯、新娘灯、大疔黄、土三七、叶生根、番鬼牡丹、叶爆芽、天灯笼、枪刀草、厚面皮、著生药、大还魂、复叶落地生根、墨西哥斗笠。是景天科(Crassulaceae)，伽蓝菜属(Kalanchoe)中一种极易栽培的观赏植物。景天科植物有其特殊的光合作用方式景天酸代谢，景天酸代谢途径是一种植物应对干旱环境的生理生态适应，是光合作用的一条重要节水型途径。宽叶不死鸟原产非洲马达加斯加地区，多年生肉质草本植物，株高50～100cm，茎单生且直立，基部木质化，叶片肉质，叶背具有不规则淡红褐斑纹，叶长15～20cm，边缘锯齿，能够自发地在叶片边缘锯齿处产生胎生苗从而进行无性生殖，聚伞状圆锥花序，宽筒状下垂，淡灰紫色。宽叶不死鸟的胎生苗在叶片边缘锯齿处发生，对称地排列于叶片边缘缺刻处；待到根系系统形成时，胎生苗从母叶上脱落，掉在地上并成长为新的植株。宽叶不死鸟因其奇特的造型而成为一种重要的园艺观赏植物，不仅可以独自盆栽观赏以及作为植物配制中的背景植物，而且作为冬切花能在温度低的条件下保持较长花期。此外，宽叶不死鸟也可以作为科学研究的一个重要模型：宽叶不死鸟在景天酸代谢植物的生理生化、系统进化方面扮演着非常重要的角色；宽叶不死鸟不通过种子形成体细胞胚的能力为研究体细胞胚胎发生过程提供了一个极具吸引力的模型。因为宽叶不死鸟有着重要的园艺经济价值与科研价值，所以建立一个以宽叶不死鸟作为模型的研究平台有着重要的意义。农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中。农杆菌介导的植物基因转化虽然比较常见，但由于植物基因的屏障作用，农杆菌并非能够介导任意植物基因。宽叶不死鸟的基因屏障作用较强，目前还没有文献和专利报道过利用农杆菌成功将外源基因导入到宽叶不死鸟中。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术无法在宽叶不死鸟中建立农杆菌介导转化体系，提供了一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，所述方法能够打破宽叶不死鸟的基因屏障，使用农杆菌介导宽叶不死鸟转化，打通宽叶不死鸟农杆菌介导高效转染体系，这是使宽叶不死鸟快速获得目的性状的第一步，也是较为重要的一步。本专利技术的技术方案如下：一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：步骤(1)无菌苗培养：摘取带宽叶不死鸟的小芽，进行清洗灭菌；将清洗灭菌后的小芽接种到SH基础培养基中，小芽均匀分布在培养基上进行光照培养；将长至3～5cm高的苗整株取出，切成小段，每段带有一个叶节，然后把叶节接入SH基础培养基中，进行扩繁培养得到宽叶不死鸟幼苗；所述宽叶不死鸟叶片清洗灭菌操作如下：用流水冲洗除去叶片表面的灰尘和泥土，使用75％酒精消毒50～70s，用无菌水涮洗3～5次，转移到无菌培养瓶中，加入0.1～0.2％的升汞消毒3～5min，升汞倒回原来的瓶中，最后用无菌水洗5-7次。所述SH基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高温灭菌20～30min，SH基础配方成分如下：硝酸钾2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1，以下步骤所述的SH基础配方也采用该配方。所述光照培养的条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培养15～20天。所述扩繁培养的条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃培养15～20天。步骤(2)侵染和共培养：将扩繁培养后的宽叶不死鸟幼苗取出，并将叶片剥下，沿主叶脉方向将叶片切为2-3截，放入无菌三角瓶；加入农杆菌菌液进行侵染；结束后将叶片取出，滤去菌液，待叶片晾干后接种到垫有滤纸的共培养基中进行共培养；所述含有AS的农杆菌菌液的OD600为0.4～0.8，AS终浓度为100～500μmol/L；侵染期间将叶片与含有AS(乙酰丁香酮)的农杆菌菌液轻轻摇匀，静置1～2h，静置过程中采用0.5～0.9MPa真空处理40～80min。所述共培养培养基由以下成分组成：SH基础配方、2，4-D 0.1～0.9mg/L、NAA 0.2～1.0mg/L、6-BA 1.0～3.0mg/L、蔗糖20～50g/L、葡萄糖10～50g/L、200～500ul/L AS、琼脂8～16g/L；所述共培养的条件为：22～26℃暗培养3～5天，共培养基中采用的激素组合及加入量能够保证侵染后的宽叶不死鸟叶片存活和正常生长。步骤(3)筛选和分离抗性苗：共培养结束后，将叶片转接到筛选培养基上进行筛选培养，有少部分活下来并分化出小芽；将小芽转接到抗性苗培养基中进行抗性苗分离培养；然后将分离出的抗性苗再转接到新的抗性苗培养基中进行抗性苗生长培养；所述筛选培养基由以下成分组成：SH基础配方、2,4-D 0.1～1.2mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、6-BA0.3～0.9mg/L、蔗糖20～60g/L、Hyg 10～40mg/L、carb 250～750mg/L、cef 250～750mg/L、琼脂8～16g/L；筛选培养基中抗生素组合以及抗生素添加量能有效抑制农杆菌生长，筛选出抗性阳性苗。所述筛选培养条件如下：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃光照培养15～20天。所述抗性苗培养基由以下成分组成：SH基础配方、蔗糖30～60g/L、carb 250～750mg/L、cef250～750mg/L、琼脂8～16g/L。步骤(3)所述抗性苗分离培养的条件：当抗性苗长大到2mm长度，就可以进行分离培养；抗性苗生长培养的条件为：光照强度1500～2500lx，每天光照12～14h，22～26℃光照培养15～20天。步骤(4)验证：提取获得的抗性苗的叶片的DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染宽叶不死鸟的阳性苗，农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系。本专利技术农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的要点如下：农杆菌植物转化虽然比较常见，但一般都针对水稻等谷物植物；由于观赏类植物的基因屏障作用较强，农杆菌很难侵染到观赏植物基因中。以宽叶不死鸟为模型的研究平台，建立宽叶不死鸟的组织培养体系以及转基因体系的重点在于共培养、筛选和抗性苗分离。而共培养基、筛选培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)宽叶不死鸟组织培养：摘取带宽叶不死鸟的小芽，进行清洗灭菌；将清洗灭菌后的小芽接种到SH基础培养基中进行光照培养；将长至3～5cm高的苗整株取出，切成小段，每段带有一个叶节，然后把叶节接入SH基础培养基中，进行扩繁培养得到宽叶不死鸟幼苗；步骤(2)侵染和共培养：将扩繁培养后的宽叶不死鸟幼苗取出，并将叶片剥下，沿主叶脉方向将叶片切为2‑3截，放入无菌三角瓶；加入农杆菌菌液进行侵染；结束后将叶片取出，滤去菌液，待叶片晾干后接种到垫有滤纸的共培养基中进行共培养；步骤(3)筛选和分离抗性苗：共培养结束后，将叶片转接到筛选培养基上进行筛选培养，部分活下来并分化出小芽；将小芽转接到抗性苗培养基中进行抗性苗分离培养；然后将分离出的抗性苗再转接到新的抗性苗培养基中进行抗性苗生长培养；所述筛选培养基由以下成分组成：SH基础配方、2,4‑D 0.1～1.2mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、6‑BA0.3～0.9mg/L、蔗糖20～60g/L、Hyg 10～40mg/L、carb 250～750mg/L、cef 250～750mg/L、琼脂8～16g/L；步骤(4)验证：提取获得的抗性苗的叶片的DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染宽叶不死鸟的阳性苗，即农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系。...

【技术特征摘要】
1.一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)宽叶不死鸟组织培养：摘取带宽叶不死鸟的小芽，进行清洗灭菌；将清洗灭菌后的小芽接种到SH基础培养基中进行光照培养；将长至3～5cm高的苗整株取出，切成小段，每段带有一个叶节，然后把叶节接入SH基础培养基中，进行扩繁培养得到宽叶不死鸟幼苗；步骤(2)侵染和共培养：将扩繁培养后的宽叶不死鸟幼苗取出，并将叶片剥下，沿主叶脉方向将叶片切为2-3截，放入无菌三角瓶；加入农杆菌菌液进行侵染；结束后将叶片取出，滤去菌液，待叶片晾干后接种到垫有滤纸的共培养基中进行共培养；步骤(3)筛选和分离抗性苗：共培养结束后，将叶片转接到筛选培养基上进行筛选培养，部分活下来并分化出小芽；将小芽转接到抗性苗培养基中进行抗性苗分离培养；然后将分离出的抗性苗再转接到新的抗性苗培养基中进行抗性苗生长培养；所述筛选培养基由以下成分组成：SH基础配方、2,4-D 0.1～1.2mg/L、NAA 0.1～1.0mg/L、6-BA0.3～0.9mg/L、蔗糖20～60g/L、Hyg 10～40mg/L、carb 250～750mg/L、cef 250～750mg/L、琼脂8～16g/L；步骤(4)验证：提取获得的抗性苗的叶片的DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染宽叶不死鸟的阳性苗，即农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系。2.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(1)所述宽叶不死鸟叶片清洗灭菌操作如下：用流水冲洗除去叶片表面的灰尘和泥土，使用75％酒精消毒50～70s，用无菌水涮洗3～5次，转移到无菌培养瓶中，加入0.1～0.2％的升汞消毒3～5min，升汞倒回原来的瓶中，最后用无菌水洗5-7次。3.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法，其特征在于，步骤(1)所述SH基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1；pH5.2～5.8，118～125℃高温灭菌20～30min；所述SH基础配方成分如下：硝酸钾2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：生承晔，颜笑洒，张业胜，董扬，
申请(专利权)人：云南纳博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53