本发明专利技术属于转基因技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法。具体方法：以暗培养7天的芥菜下胚轴为外植体，利用载有目标基因载体的农杆菌侵染下胚轴，通过共转化，诱导培养愈伤组织，抗性筛选，脱分化等过程，成功获得转基因阳性苗。通过对阳性苗的PCR鉴定证明将目标基因成功的转到植物中表达。本发明专利技术建立了一个芥菜高效的再生体系，为研究芥菜农杆菌芥导的转基因技术做好基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物组织培养和转基因
，具体涉及涉及一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法。技术背景芥菜，是十字花科芸薹属中的一年或多年生草本植物。它主要作为油料作物和调味品种植。芥菜包含丰富的种质资源，具有非常重要的科学研究价值和经济使用价值。芥菜作为鲜食和加工蔬菜，主要包括：根用芥菜、茎用芥菜、叶用芥菜和薹用芥菜，在中国主要做蔬菜进行种植。作为油料作物主要是种子用芥菜，目前油用芥菜在印度、加拿大、澳大利亚等国的干旱地区被广泛种植。自1984年世界首例转基因烟草取得成功之后，越来越多的作物转基因体系都得到成功的建立。在芸薹属作物中，目前仅有甘蓝型油菜的转基因体系被成功建立，主要用于培育抗除草剂的转基因品种和基因功能验证。但是在国内，白菜、甘蓝和芥菜等作物的转基因体系还没有得到很好的建立。遗传转化技术可以用来进行转基因抗性品种的培育，主要用于培育抗除草剂和抗病虫害的转基因品种。同时遗传转化技术也能够用于重要基因功能研究的技术手段，包括基因功能互补验证、过表达分析、启动子分析、基因沉默、基因编辑等。随着基因编辑技术的出现，可以通过CRISPR/Cas9等技术实现对芥菜基因组的定点突变，更好的提高芥菜的产量、品质和抗性。随着基因组学和分子生物学的发展，通过同源克隆或者图位克隆的方法，在芥菜中控制花期、产量、抗病、抗虫、品质等重要农艺性状的基因将被进一步研究。转基因体系的建立对基因定点编辑技术的应用和基因功能的验证起着不可或缺的作用，在生产和实践中尤其重要。目前关于芥菜的遗传转化技术的报道有原位真空渗入遗传转化法和以子叶胚或者下胚轴为外植体进行的农杆菌介导的遗传转化方法。目前的方法存在转化率低，费时费力等不利因素。为了大幅度提高转化效率，以下胚轴作为外植体进行农杆菌介导的芥菜的遗传转化，利用芥菜00-6-102B为实验材料，大大的提高了转化效率。因此，建立农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法，将为芥菜的遗传研究、基因功能验证等提供可靠的保证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法，建立快速，高效的农杆菌转化芥菜再生体系，提高转化率，为芥菜转基因技术服务。具体转化步骤如下：一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法，包括下述步骤：1).将灭菌后的芥菜种子置于M0培养基中，暗培养5-7天，长成芥菜黄化苗。MO培养基：MS培养基2.2-2.4g/L+琼脂粉2.5g/L；优选的，芥菜种子的灭菌包括下述步骤：取芥菜种子，用75％酒精浸泡1-2分钟，再用0.15％的升汞灭菌8-10分钟。灭菌完成后用灭菌的蒸馏水清洗至少3次，每次2-3分钟。2).切取芥菜黄化苗下胚轴作为外植体，将下胚轴切成长度为0.8-1.0cm小段，切取过程中保证切口平整，将其置于DM培养液保湿。DM培养液的配方包括：MS培养基4.4-4.6g/L+蔗糖30g/L+乙酰丁香酮100mg/L；3).利用常规方式将含有目的基因表达载体的农杆菌菌液侵染外植体；优选的，含有目的基因表达载体的农杆菌菌液的准备包括：将含有目的基因表达载体的农杆菌菌液4000rpm离心15min，弃上清。用30-35ml的DM培养液重悬，将重悬后的菌转入新的灭菌三角瓶中，再放入28℃摇床培养30min-1h；侵染步骤包括：将准备好的菌液倒入装有外植体的平皿，浸染10-15分钟，期间每隔2-3分钟摇一次，保证菌液与外植体充分接触。侵染完毕后，将外植体转平铺至放有灭菌滤纸的空培养皿中，让多余的菌液被吸干；4).将被侵染后的外植体转到M1培养基中，黑暗条件共培养40-48h后，将M1上的外植体转入M2培养基中，光照条件下进行培养。M1培养基的配方包括：MS4.4g/L+蔗糖30g/L+甘露醇18g/L+2,4-D1mg/L+激动素0.3mg/L+乙酰丁香酮100mg/L+琼脂糖6g/L；M2培养基的配方包括：MS4.4g/L+蔗糖30g/L+甘露醇18g/L+2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L+激动素0.3mg/L+卡那霉素50mg/L+琼脂糖6g/L+亚硫酸钠和硝酸银形成的络合物0.1mol/L+特美汀100mg/L；5).三周后将M2培养基中的外植体转入M3培养基中，每3-4周更换新的M3培养基，直至长出愈伤组织并诱导出现有生长点绿芽，切取含有生长点的绿芽。M3培养基的配方包括：MS4.4g/L+葡萄糖10g/L+木糖0.25g/L+MES0.6g/L+琼脂糖6g/L+反式玉米素2mg/L+特美汀100mg/L+生长素0.1mg/L+卡那霉素25mg/L；6).将含有生长点的绿芽转入M4培养基中进行生根培养，25-35天即可移入小花砵中炼苗生长。M4培养基的配方包括：MS4.4-4.6g/L+琼脂糖10g/L；以上过程保证无菌操作，黑暗条件培养和光照条件培养都在光照培养室中进行；所有培养基的pH都调至5.8-6.0之间；所述的光照条件培养：16h光照，800-1000Lux,8h黑暗，温度25℃。优选的，以上方案中所述的表达载体是pCAMBIA2300商业化载体，农杆菌菌株GV3101。优选的，所述的芥菜为芥菜00-6-102B。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点:利用芥菜00-6-102B成功的进行遗传转化实验，并且遗传转化的转化效率高达20％以上。在组培阶段，所需种子量相对较少，繁殖速度快，从种子灭菌开始，到最后完成遗传转化移栽，一般70-90天，污染率比较低。附图说明图1为以芥菜型油菜下胚轴为外植体获得抗性苗生长情况示意图。其中图1中a:黑暗培养5-7天的黄化苗；图1中b:M2培养基分化愈伤组织；图1中c:M3培养基上的愈伤组织诱导出含有生长点的芥菜；图1中d：M4培养基上进行生根培养。图2芥菜hauCMS不育基因orf288(73-288aa)功能验证表达载体示意图。35Spro代表CaMV35S启动子；orf288(73-288aa)为不育基因orf288截短的部分；Rfp为油菜polCMS恢复基因的信号肽；NOS为终止子。图3抗性植株的PCR检测其中图3上排为PS：rfp28873-288aa的转基因阳性植株；图3下排为PS:orf28873-288aa的转基因阳性植株。图4转基因株系表型转基因PS：rfp28873-288aa和PS:orf28873-288aa的阳性苗的花药都表现为雄性不育。具体实施方式实施例1：本专利技术实施例1以芥菜hauCMS细胞质雄性不育基因的遗传转化为例进行说明：一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法，包括下述步骤：1)含有目的基因载体的构建：CaMV35S启动子连接在pCAMBIA2300载体上，所用酶切位点为HindIII和PstI；PS：rfp28873-288aa载体的构建：利用重叠PCR技术将信号肽Rfp与rfp28873-288aa的核苷酸序列进行重叠，所用酶切位点包括：PstI和BamHI。所需引物包括：d-Rfp-L(PstI)：AACTGCAGATGGTGTTGAGGACACAGAGAT；d-Rfp-R：TCGTATCAAAGAGATTACCATTCTATCGCTGGTGAGACCAGA；d-orf215-L：TCTGGTCTCACCAGC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法，包括下述步骤：1）.将灭菌后的芥菜种子置于M0培养基中，暗培养5‑7天，长成芥菜黄化苗；MO培养基：MS培养基 2.2‑2.4 g/L + 琼脂粉 2.5g/L ；2）.切取芥菜黄化苗下胚轴作为外植体，将下胚轴切成长度为0.8‑1.0cm小段，切取过程中保证切口平整，将其置于DM培养液保湿；DM培养液的配方包括：MS培养基 4.4‑4.6 g/L +蔗糖 30 g/L +乙酰丁香酮 100mg/L；3）. 利用常规方式将含有目的基因表达载体的农杆菌菌液侵染外植体；4）. 将被侵染后的外植体转到M1培养基中，黑暗条件共培养40‑48h后，将M1上的外植体转入M2培养基中，光照条件下进行培养；M1培养基的配方包括：MS 4.4g/L+蔗糖 30 g/L+甘露醇18g/L +2,4‑D 1mg/L+激动素0.3mg/L +乙酰丁香酮 100mg/L+琼脂糖 6g/L；M2培养基的配方包括：MS 4.4g/L+蔗糖 30g/L+甘露醇 18g/L+ 2,4‑二氯苯氧乙酸 1mg/L+激动素0.3mg/L+卡那霉素50mg/L +琼脂糖 6g/L+亚硫酸钠和硝酸银形成的络合物 0.1mol/L+特美汀 100mg/L；5）. 三周后将M2培养基中的外植体转入M3培养基中，每3‑4周更换新的M3培养基，直至长出愈伤组织并诱导出现有生长点绿芽，切取含有生长点的绿芽；M3培养基的配方包括：MS 4.4g/L+葡萄糖 10g/L+木糖 0.25g/L+MES 0.6g/L+琼脂糖 6g/L+反式玉米素 2mg/L+特美汀 100mg/L+生长素 0.1mg/L+卡那霉素 25mg/L；6）. 将含有生长点的绿芽转入M4培养基中进行生根培养，25‑35天即可移入小花砵中炼苗生长；M4培养基的配方包括：MS 4.4‑4.6 g/L +琼脂糖 10g/L；以上过程保证无菌操作，黑暗条件培养和光照条件培养都在光照培养室中进行；所有培养基的pH都调至5.8‑6.0之间；所述的光照条件培养：16h光照，800‑1000 Lux, 8h黑暗，温度25℃。...
【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的芥菜的遗传转化方法，包括下述步骤：1）.将灭菌后的芥菜种子置于M0培养基中，暗培养5-7天，长成芥菜黄化苗；MO培养基：MS培养基2.2-2.4g/L+琼脂粉2.5g/L；2）.切取芥菜黄化苗下胚轴作为外植体，将下胚轴切成长度为0.8-1.0cm小段，切取过程中保证切口平整，将其置于DM培养液保湿；DM培养液的配方包括：MS培养基4.4-4.6g/L+蔗糖30g/L+乙酰丁香酮100mg/L；3）.利用常规方式将含有目的基因表达载体的农杆菌菌液侵染外植体；4）.将被侵染后的外植体转到M1培养基中，黑暗条件共培养40-48h后，将M1上的外植体转入M2培养基中，光照条件下进行培养；M1培养基的配方包括：MS4.4g/L+蔗糖30g/L+甘露醇18g/L+2,4-D1mg/L+激动素0.3mg/L+乙酰丁香酮100mg/L+琼脂糖6g/L；M2培养基的配方包括：MS4.4g/L+蔗糖30g/L+甘露醇18g/L+2,4-二氯苯氧乙酸1mg/L+激动素0.3mg/L+卡那霉素50mg/...
【专利技术属性】
技术研发人员：衡双平，魏超，陈凤仪，沈金雄，傅廷栋，涂金星，马朝芝，易斌，文静，李兴华，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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