一种自发光烟草及转基因方法技术

本发明专利技术公开了一种自发光烟草及转基因方法。所述自发光烟草通过发光基因与质粒载体构建发光基因‑质体载体表达载体，发光基因‑质体载体表达载体通过质体转基因技术导入到烟草叶片中，烟草叶片通过组织培养得到。所述质粒载体为p‑DK6质粒载体，碱基序列如SEQ ID NO.1所示；所述发光基因为LUX基因。本发明专利技术采用质体转基因技术得到自发光烟草，该方法依赖于外源基因与叶绿体基因的同源重组，具有定点整合外源基因并使之稳定遗传，环境安全性好，基因产物区域化，表达量极高等优点而受到科学家的青睐。

Self luminous tobacco and transgenic method

The invention discloses a self luminous tobacco and a transgenic method. The self-luminescent tobacco is constructed by luminescent gene and plasmid vector to construct a luminescent gene plastid vector expression vector, and the luminescent gene plastid vector expression vector is introduced into the tobacco leaves by plastid transgene technology, and the tobacco leaves are obtained by tissue culture. The plasmid carrier is p_DK6 plasmid carrier, and the base sequence is shown as SEQ ID NO.1, and the luminescent gene is LUX gene. The method relies on homologous recombination of exogenous genes and chloroplast genes, has the advantages of site-directed integration and stable inheritance of exogenous genes, good environmental safety, regionalization of gene products and high expression, and is favored by scientists.

【技术实现步骤摘要】
一种自发光烟草及转基因方法
本专利技术属于转基因发光植物
，尤其涉及一种自发光烟草及转基因方法。
技术介绍
在生物进化的过程中，形成了自发荧光的藻类，真菌，细菌，昆虫等物种。但是，自然界中却鲜有自发荧光的植物。全世界关于发光烟草的研究涉及方方面面，大多发光烟草的专利都是以将某些发光化合物涂在植物表面，或者是对植物培养装置进行改造，在使植物在黑暗中发出亮光。基因工程的蓬勃发展，使得科学家对生物的发光机制有了分子层面的研究。科学家通过将发光基因导入植物细胞的染色体中，从而获得相应发光植株。在自然界，动物、微生物都有能发光的，唯独只有植物在进化过程中没有发光这一现象，故发光植物具有很大的观赏价值，同时，电影《阿凡达》中的荧光植物给人类极大的憧憬和向往，几年来，人类对荧光植物的好奇心从未减弱，荧光植物的问世也具有极大的商业价值。申请号为CN201310396243.7的中国专利申请公开了一种发光仙人球。该发光仙人球采用以下方法得到：荧光素酶基因群PCR扩增；荧光素酶基因群与pM-18T载体的构建；基因测序；融合基因转入大肠杆菌，测序；目的基因与表达载体的连接；特定启动子与表达载体的构建；融合基因转入农杆菌；将基因及荧光素的合成前提物一起转入植物；以及进行转代筛选稳定发光烟草体。采用农杆菌转化法将发光基因整合到植物染色体基因中，拷贝数较低，导致转化率很低，植物发光不明显，该方法应用到烟草中几乎得不到发光烟草。“AutoluminescentPlants(Krichevsky,etal,2010,Plosone)”一文中以Nicotianatabacum(四倍体烟草)为受体材料，质粒载体由质体特有启动子Prrn启动aadA(筛选基因)和LUX操纵子基因，来作为外源基因表达盒，同时选择rps12-trnV和trnA-trnI两种同源位点作为对照，获得的自发光烟草。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种自发光烟草及转基因方法。本专利技术能够定点整合，且拷贝数高，顺利得到高表达的自发光烟草；其自发光烟草在没有外力作用(外加底物或蓝紫光激发等)下，能够自发出裸眼可见的荧光。本专利技术第一方面，提供一种自发光烟草，其特征在于，所述自发光烟草通过发光基因与质粒载体构建发光基因-质体载体表达载体，发光基因-质体载体表达载体再通过质体转基因技术导入到烟草叶片中，烟草叶片通过组织培养得到。所述质粒载体为p-DK6质粒载体，碱基序列如SEQIDNO.1所示。所述p-DK6质粒载体的组成部分：启动子，终止子，筛选抗性基因(aadA)，多克隆位点，叶绿体基因组同源序列(ORF131，16SrRNA)等。质粒载体中的筛选基因aadA和外源基因LUX分别由质体特异启动子PpsbA和Prrn启动，组成两套基因表达盒，在光量子的表达水平来看，采用两个启动子分别启动的效果较高。所述发光基因为LUX基因，可通过人工合成获得，发光基因LUX最早发现于海洋发光细菌中，海洋发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490nm之间，在黑暗处肉眼可见。本专利技术第二方面，提供一种自发光烟草的转基因方法，所述转基因方法操作如下：通过基因合成得到发光基因LUX序列，并进行PCR扩增；然后采用NcoI限制性内切酶和XbaI限制性内切酶切p-DK6质粒载体，获得线性化p-DK6质粒载体，将发光基因LUX连接到线性化p-DK6质粒载体上，获得发光基因-质体载体，采用基因枪将发光基因-质体载体轰击导入经高渗培养后的烟草叶片中；导入有发光基因-质体载体的烟草叶片经过恢复培养基培养后，然后在筛选培养基中进行筛选培养，得到阳性愈伤组织，阳性愈伤组织继续继代筛选培养获得同质化100％的愈伤组织，进而在生根培养基中诱导成苗得到自发光烟草；所述基因枪轰击烟草叶片的条件如下：基因枪氦气压至1050～1150psi，轰击距离为6cm或9cm。所述发光基因LUX进行PCR扩增时的引物对如下：前引物primer-F：AGGGAGGGATCCATGGGAATACCAAAGGAGATTAC；后引物primer-R：TAATGTCTACTCTAGAAATATCCCTATAAATAGAAC。所述高渗培养条件如下：高渗培养基配方为MS基础培养基+甘露醇0.05～0.3mol/L+山梨醇0.05～0.2mol/L+蔗糖25～35g/L+琼脂6.8～9g/L，pH5.6～6；高渗处理时间为3～5h，常温密封放置；所述恢复培养条件如下：恢复培养基配方为MS基础培养基+6-BA0.5～1.5mg·L-1+NAA50～180ug·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂6.8～9g·L-1，pH5.6～6；恢复培养为暗培养，温度为22～26℃，培养时间为5～10天。导入有发光基因-质体载体的烟草叶片经过2～4轮筛选培养得到阳性愈伤组织；筛选条件如下：筛选培养基配方为MS基础培养基+6-BA0.5～1.5mg·L-1+NAA50～180ug·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂6.8～9g·L-+壮观霉素500～2000mg/L，pH5.6～6；筛选培养温度为22～26℃，光照强度为1500～2500lux，每天光照时间为12～14小时，筛选培养时间为70～85天；或者筛选培养温度为22～26℃，光照强度为8000～11000lux，每天光照时间为14～16小时，筛选培养时间为35～45天。获得的阳性愈伤组织继续切成小片，放置于继代筛选培养基中筛选1～3轮得到同质化100％的阳性愈伤组织；继代筛选条件如下：继代筛选培养基配方为MS基础培养基+6-BA0.5～1.5mg·L-1+NAA50～180ug·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂6.8～9g·L+壮观霉素500～2000mg/L，pH5.6～6.2；继代筛选培养温度为25～28℃，光照强度为8000～12000lux，每天光照时间为12～18小时，继代筛选时间为30～60天。同质化100％的愈伤组织在暗室里能裸眼观察到荧光，将愈伤组织切成小片放置于生根培养基中获得能自发光的烟草，生根培养基成份如下：生根培养基配方为MS0培养基+蔗糖25～35g/L+壮观霉素500～2000mg/L+植物凝胶2～4g/L，pH5.6～6.2。本专利技术采用的MS基础培养基配方为：硝酸铵30～35g·L-1，硝酸钾36～40g·L-1，磷酸二氢钾3～3.8g·L-1，硫酸镁7～7.5g·L-1，氯化钙8～9g·L-1，碘化钾0.1～0.2g·L-1，硼酸1.1～1.4g·L-1，四水硫酸锰4～5g·L-1，七水硫酸锌1.5～1.9g·L-1，二水钼酸钠0.02～0.1g·L-1，五水硫酸铜4～6mg·L-1，六水氯化钴4.5～5.5mg·L-1，七水硫酸亚铁5～6g·L-1，乙二胺四乙酸二钠7～8g·L-1，甘氨酸19.5～21.3mg·L-1，肌醇95～105mg·L-1，盐酸硫胺素18～22mg·L-1，盐酸吡哆素99～104mg·L-1，烟酸197～102mg·L-1。考虑到采用农杆菌转化法将发光基因整合到植物核基因中，拷贝数低，转化率较低，本专利技术将发光基因运用质体转基因技术导入植物细胞的叶绿体基因组中，外源基因整合在本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种自发光烟草，其特征在于，所述自发光烟草通过发光基因与质粒载体构建发光基因‑质体载体表达载体，发光基因‑质体载体再通过质体转基因技术导入到烟草叶片中，烟草叶片通过组织培养得到。

【技术特征摘要】
1.一种自发光烟草，其特征在于，所述自发光烟草通过发光基因与质粒载体构建发光基因-质体载体表达载体，发光基因-质体载体再通过质体转基因技术导入到烟草叶片中，烟草叶片通过组织培养得到。2.如权利要求1所述的自发光烟草，其特征在于，所述质粒载体为p-DK6质粒载体，碱基序列如SEQIDNO.1所示。3.如权利要求1所述的自发光烟草，其特征在于，所述发光基因为LUX基因。4.一种自发光烟草的转基因方法，其特征在于，所述转基因方法操作如下：通过基因合成得到发光基因LUX序列，并进行PCR扩增；然后采用NcoI限制性内切酶和XbaI限制性内切酶切p-DK6质粒载体，获得线性化p-DK6质粒载体，将发光基因LUX连接到线性化p-DK6质粒载体上，获得发光基因-质体载体，采用基因枪将发光基因-质体载体轰击导入经高渗培养后的烟草叶片中；导入有发光基因-质体载体的烟草叶片经过恢复培养基培养后，然后在筛选培养基中进行筛选培养，得到阳性愈伤组织，阳性愈伤组织继续继代筛选培养获得同质化100％的愈伤组织，进而在生根培养基中诱导成苗得到自发光烟草。5.如权利要求4所述的自发光烟草的转基因方法，其特征在于，所述基因枪轰击烟草叶片的条件如下：基因枪氦气压至1050～1150psi，轰击距离为6cm或9cm。6.如权利要求4所述的自发光烟草的转基因方法，其特征在于，所述发光基因LUX进行PCR扩增时的引物对如下：前引物primer-F：AGGGAGGGATCCATGGGAATACCAAAGGAGATTAC；后引物primer-R：TAATGTCTACTCTAGAAATATCCCTATAAATAGAAC。7.如权利要求4所述的自发光烟草的转基因方法，其特征在于，所述高渗培养条件如下：高渗培养基配方为MS基础培养基+甘露醇0.05～0.3mol/L+山梨醇0.05～0.2mol/L+蔗糖25～35g/L+琼脂6.8～9g/L，pH5.6～6；高渗处理时间为3～5h，常温密封放置；...

【专利技术属性】
技术研发人员：段康，张晨，赵娟，生承晔，张业胜，王文，董扬，
申请(专利权)人：云南纳博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53