一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法技术

本发明专利技术公开了一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：步骤(1)种子萌发无菌苗阶段；步骤(2)无菌苗扩繁阶段；步骤(3)农杆菌培养阶段；步骤(4)侵染和共培养阶段；步骤(5)筛选阶段；步骤(6)生根阶段和步骤(7)阳性检测阶段。本发明专利技术顺利建立了康乃馨农杆菌介导高效转染体系，为进一步利用转基因技术培育康乃馨新品种作出了充分准备，进而可以获得传统育种方式无法培育的新品种；在本发明专利技术提供的方法中，愈伤组织诱导率高，保存效果好，为遗传转化提供良好受体；转化效率高，适合大规模工业生产和商业育种。

A method for the establishment of efficient transfection system mediated by Agrobacterium carnation

【技术实现步骤摘要】
一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法
本专利技术属于农杆菌介导植物转化
，尤其涉及一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法。
技术介绍
康乃馨(Dianthuscaryophyllus)体态玲珑、斑斓雅洁、端庄大方、芳香清幽，是美好典雅的典范。人们常将康乃馨作为送给母亲的礼物，用它来表达对母亲的爱与祝福。康乃馨随着母亲节的兴起，成为全球销量最大的花卉。康乃馨是肯尼亚的主要出口种类，也是美洲哥伦比亚最大的出口花卉品种，在亚洲的日本、韩国、马来西亚等国都有大量栽培。在欧洲，德国、匈牙利、意大利、波兰、西班牙、土耳其、英国和荷兰等国栽培的规模也很大。康乃馨为石竹科多年生草本植物，包括许多变种与杂交种，在温室里几乎可以连续不断开花。康乃馨原产地中海地区，主要分布于欧洲温带及我国福建、湖北等地，是世界应用最普遍的花卉之一。康乃馨茎秆硬脆，常单生枝端，有时2或3朵，香气浓郁，常见色彩有粉色、红色或白色。康乃馨大部分代表了爱、魅力和尊敬之情。与玫瑰不同的是，康乃馨代表的爱表现较清淡和温馨，适于亲情之爱，所以儿女多将康乃馨献给自己的母亲。农杆菌介导的植物基因转化系统目前广泛应用于植物基因工程研究。根癌农杆菌中含Ti质粒，该质粒的部分DNA片段可整合到宿主细胞中，从而整合到植物的基因组中。“根癌农杆菌法转化康乃馨的条件探索(安徽农业科学,Sci.2008,36(13):5329-5330)”一文以康乃馨叶片为受体材料,.通过抗G418(一种抗生素)筛选,探讨预培养时间、根癌农杆菌菌液浓度、共培养时间等因素对根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的影响。这篇文献仅仅对根癌农杆菌转化康乃馨的条件进行摸索，并指出20mg/mlG418是康乃馨叶片转化的适宜浓度；随着预培养时间的增加,康乃馨叶片的存活率降低,预培养2～3d时抗性芽分化率较高；当根癌农杆菌OD600为0.5～0.8时,抗性芽分化率较高,适合康乃馨转化；共培养2～3d时,康乃馨叶片生长状态好,抗性芽分化率最高；预培养、共培养各2～3d,菌液浓度OD600为0.5～0.8是根癌农杆菌介导康乃馨遗传转化的适宜条件。在这篇文献中最高的芽分化率为6.7％，转化效率很低。范惠琴等人在“发根农杆菌Ri质粒转化康乃馨初步研究(上海农业学报2001,17(1):35～38)”一文中介绍了利用具有Ri质粒的发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)Pri15834对康乃馨组培苗的带叶茎节进行转化试验。转化后的外植体在K0附加500mg/L羧苄青霉素培养基上培养2～3周后,受感染的伤口部位长出无向地性的毛状根,频率为37.07％。将毛状根切碎分别在K0、K1、K2培养基上继续培养3周,毛状根在K0上表现为无限生长,在K1上主要表现为长愈伤组织,频率为51.42％,而在K2上则主要表现为长绿苗,频率为25％。这说明发根农杆菌的Ri质粒已整合到康乃馨细胞基因组中并得到表达。在该文献中，虽然首次使用的发根农杆菌Ri质粒进行转化，较以往的报道的转化频率有所提高，但也只提高到转化频率为37.07％，转化率依然较低，而且采用Ri质粒转化，稳定性不高。
技术实现思路
针对现有技术康乃馨转化效率低的不足，本专利技术提供一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，使用农杆菌介导康乃馨转化，打通康乃馨农杆菌介导高效转染体系。这是通过农杆菌转染体系培育新型康乃馨最为重要的一步。建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系意味着能够突破康乃馨自身遗传屏障，获得难以通过传统育种方式生产的新品种。本专利技术的技术方案如下：一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，所述方法包括以下步骤：步骤(1)种子萌发无菌苗阶段：将康乃馨种子消毒灭菌后半嵌接种(一半置于培养基中，一半裸露在空气中)于基础培养基中培养成无菌苗；培养条件为：22～26℃光照培养，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx，培养时间为30～90天；所述康乃馨种子消毒杀菌过程如下：使用无菌水冲洗3～15次，在75％乙醇中浸泡20～120s，再使用无菌水清洗3～15次，在0.1～0.2％升汞中浸泡3～15min，再使用无菌水清洗种子8～15次，并放在滤纸上晾干。所述基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min；SH基础配方成分如下：硝酸钾2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫酸锰10～20mg·L-1，二水钼酸钠0.1～0.2mg·L-1，七水硫酸锌1～2mg·L-1；以下步骤中所述的SH基础配方也采用该配方。步骤(2)无菌苗扩繁阶段：将步骤(1)中萌发长到3～10cm的无菌苗切成带有叶节的小段，不能伤害叶节，把叶节接入到基础培养基中；所述基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1；pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20～30min。无菌苗扩繁培养条件为：22～26℃光照培养15～20天，每天光照12～14h，光照强度1500～2500lx。步骤(3)农杆菌培养阶段：将农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平的YM培养基中进行培养；农杆菌在YM培养基中培养后离心，2000～4000r/min，4～8℃离心10～20min，弃上清，下层加入重悬液使OD600值达到0.4～0.8，最后向菌液中加入AS使终浓度为50～200μmol·L-1，混匀备用；所述YM培养基成分如下：蛋白胨10-20g/L，酵母提取物5-10g/L，氯化钠10-20g/L，YM培养基可从市场购买得到；农杆菌在YM培养基中培养条件如下：26～30℃培养10～14h，有无光照不影响效果。所述重悬液为SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1。农杆菌菌液采用其他培养方法制备得到也可以。步骤(4)侵染和共培养阶段：将步骤(2)获得的无菌苗切成2～7mm2的叶片块放入三角瓶中，向三角瓶中倒入步骤(3)获得的菌液，三角瓶口密封，抽真空侵染，侵染后倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养培养基中进行暗培养得到愈伤组织；共培养基上垫有滤纸，一般为1～3层，阻碍农杆菌过度生长，也可以延长共培养时间，提高存活率。所述共培养基成分如下：SH基础配方+TDZ0.01～2.0mg·L-1+IBA0.1～2.0mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+葡萄糖10～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+AS50～200μmol·L-1；共培养基pH5.2～5.8，118～125℃灭菌20-30min；侵染时间过短，农杆菌与康乃馨组织接触时间短，侵染效果不好，导致转换率低；侵染时间过长，造成康乃馨叶受损、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)种子萌发无菌苗阶段：将康乃馨种子消毒灭菌后半嵌接种于基础培养基中培养成无菌苗；步骤(2)无菌苗扩繁阶段：将步骤(1)中萌发长到3～10cm的无菌苗切成带有叶节的小段，把叶节接入到基础培养基中；步骤(3)农杆菌培养阶段：将农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平的YM培养基中进行培养；步骤(4)侵染和共培养阶段：将步骤(2)获得的无菌苗切成2～7mm

【技术特征摘要】
1.一种建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤(1)种子萌发无菌苗阶段：将康乃馨种子消毒灭菌后半嵌接种于基础培养基中培养成无菌苗；步骤(2)无菌苗扩繁阶段：将步骤(1)中萌发长到3～10cm的无菌苗切成带有叶节的小段，把叶节接入到基础培养基中；步骤(3)农杆菌培养阶段：将农杆菌加入到同时添加了卡那霉素和利福平的YM培养基中进行培养；步骤(4)侵染和共培养阶段：将步骤(2)获得的无菌苗切成2～7mm2的叶片块放入三角瓶中，向三角瓶中倒入步骤(3)获得的农杆菌菌液，三角瓶口密封，抽真空侵染，倒去菌液，将叶片晾干，转接到共培养基中进行暗培养得到愈伤组织，共培养基上垫有滤纸；所述共培养基成分如下：SH基础配方+TDZ0.01～2.0mg·L-1+IBA0.1～2.0mg·L-1+蔗糖20～60g·L-1+葡萄糖10～60g·L-1+琼脂8～16g·L-1+AS50～200μmol·L-1；共培养基pH5.2～5.8，118～125℃灭菌20-30min；步骤(5)筛选阶段：将步骤(4)获得的进行两次筛选，培养得到幼芽；步骤(6)生根阶段：将步骤(5)中获得的幼芽转接到生根培养基培养，得到抗性苗；步骤(7)阳性检测阶段：取抗性苗的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，将PCR产物进行凝胶电泳，得到农杆菌成功侵染康乃馨的阳性苗，建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系。2.如权利要求1所述的建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，其特征在于，所述康乃馨种子消毒杀菌过程如下：使用无菌水冲洗3～15次，在75％乙醇中浸泡20～120s，再使用无菌水清洗3～15次，在0.1～0.2％升汞中浸泡3～15min，再使用无菌水清洗种子8～15次，并放在滤纸上晾干。3.如权利要求1所述的建立康乃馨农杆菌介导高效转染体系的方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中所述基础培养基的成分如下：SH基础配方+琼脂8～16g·L-1+蔗糖20～60g·L-1，pH5.2～5.8，118～125℃高压灭菌20-30min；SH基础配方为：硝酸钾2.5～5.0g·L-1，硫酸镁0.195～0.4g·L-1，磷酸二氢铵0.3～0.6g·L-1，氯化钙151～300mg·L-1，甘氨酸2～4mg·L-1，肌醇100～200mg·L-1，盐酸硫胺素0.4～0.8mg·L-1，盐酸吡哆素0.5～1.0mg·L-1，烟酸0.5～1.0mg·L-1，乙二胺四乙酸铁纳19.8～40mg·L-1，六水氯化钴0.1～0.2mg·L-1，五水硫酸铜0.2～0.4mg·L-1，硼酸5～10mg·L-1，碘化钾1～2mg·L-1，一水硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：颜笑洒，生承晔，张业胜，董扬，
申请(专利权)人：云南纳博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南,53