转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法技术

本发明专利技术公开了一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法，包括如下步骤：（1）、材料准备：经农杆菌介导获得的转基因棉花植株，通过杂交产生的后代种子，种子经硫酸脱绒，经灭菌处理后，浸泡于容器中，封口，在20～30℃下经过24h以上，待种子萌动后，去种皮接种或直接放入培养后续制备的器皿中培养；（2）、接种培养。本发明专利技术方法设计合理，把棉花转基因技术和种子发芽技术进行有机结合，对转基因抗虫棉杂交后代种质材料进行鉴别分离，去伪存真，简便、快速、高效地从转基因抗虫棉杂交后代种子中筛选出阳性转基因植株或株系，直接即可进行播种，减免了田间卡那霉素涂抹鉴定这一繁琐程序，提高育种工作的效率，缩短育种周期。

High efficiency identification and utilization of transgenic insect resistant cotton hybrid offspring Germplasm

The present invention discloses a kind of efficient identification of Transgenic Insect Resistant Cotton Hybrids germplasm and utilization method, which comprises the following steps: (1), material preparation: the transgenic cotton obtained by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation of plants through the offspring of seed, seed by acid delinting, after sterilization, immersed in a container in 20, the seal, to 30 DEG C after more than 24h, the seed germination, seed inoculation or go directly into the cultivation of the subsequent preparation of the vessel; (2), inoculation and culture. The method of the invention is reasonable in design, the transgenic cotton seed germination technology and technology organic combination, differential separation of transgenic Bt Cotton Hybrids germplasm Quweicunzhen, simple, rapid and efficient hybrid cotton seeds from transgenic screened positive transgenic plants or lines can be direct seeding, relief card field kanamycin with identification of this cumbersome procedures, improve the efficiency of breeding can shorten the breeding cycle.

【技术实现步骤摘要】
转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法
本专利技术涉及棉花育种和种植领域，具体为一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法。
技术介绍
转基因抗虫棉是指棉花细胞染色体上整合有外源抗虫基因的棉花品种。抗虫基因通常为来源于苏云金芽孢杆菌的Bt基因，Bt基因是苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis）的简称，它是一种革兰氏阳性菌，在地球上分布十分广泛。Bt基因是抗虫棉中研究最多、进展最快、应用最广泛的一类基因，它对鳞翅目昆虫有专一的杀伤作用,是一种具有特异杀虫活性的细菌，能产生多种对昆虫有特异活性的杀虫蛋白，包括cry和cyt基因编码的杀虫晶体蛋白（insecticidalcrystalproteins，简称ICPs），以及营养期分泌的杀虫蛋白Vip（vegetativeinsecticidalprotein，简称Vips）。且外源DNA表达通常表现出典型的孟德尔遗传规律。棉花抗虫育种历史不长，方法也不尽完善，转基因抗虫棉育种目标参考系统育种程序进行抗虫新品种的选育。在对品种进行农艺、经济和抗虫性状全面鉴定的基础上筛选出特别优良的转基因抗虫棉品种直接推广到生产中去利，杂种后代的处理必须将选种与抗虫鉴定相结合。在棉花选育品种过程中，通过不同性状的棉花株系进行杂交，以期获得具有不同亲本所携带的优良性状，并且一定要兼具抗虫特性，即后代材料要携带Bt基因。在转基因抗虫棉杂交后代材料中，含有大量无效或不可利用的杂交后代，在极其大量的后代材料中选择含有外源基因的目标植株是培育转基因抗虫棉的重要步骤，根据NPTⅡ基因（卡那霉素标记基因）与Bt抗虫基因紧密连锁的关系，因此在育种生产中，通过对植株抗卡那霉素特性的筛选，来获得带有Bt基因，具有抗虫特性的后代材料，转基因抗虫棉杂交后代的鉴别，一般来说，常用的方法有PCR扩增电泳检测法和田间卡那霉素涂抹鉴定法，PCR扩增电泳是目前最常用的实验室转基因植株遗传检测方法，PCR扩增电泳检测法存在诸多缺点，需要实验室和仪器，DNA制备过程复杂繁琐且实验技术要求高，大量转基因抗虫棉杂交后代需要鉴别时，实验试剂花费不菲且工作量极其巨大。田间卡那霉素涂抹鉴定，夏天高温作业，一株一叶涂抹，工作量大而繁重，受天气环境影响大且因操作的人为差异造成鉴定结果假阳性偏多，给后续的育种工作带来很大的麻烦。转基因抗虫棉杂交后代的遗传检测与筛选需要大量的工作要做，传统的PCR扩增电泳检测和田间卡那霉素涂抹已难以满足生产实验的需求。
技术实现思路
本专利技术目的在于寻求一种简便、快捷、高效的检测与筛选棉花转基因后代植株的方法，加以利用，以满足在棉花育种生产中，转基因抗虫棉杂交后代大量群体的筛选与鉴定需要。因此，专门就此要求设计了一套因地制宜、不同于实验室操作的、高效快捷、简便实用的技术方法。本专利技术是采用如下技术方案实现的：一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法，包括如下步骤：（1）、材料准备经农杆菌介导获得的转基因棉花植株，通过杂交产生的后代种子，种子经硫酸脱绒，经灭菌处理后，浸泡于容器中，封口，在20～30℃下经过24h以上，待种子萌动后，去种皮接种或直接放入培养后续制备的器皿中培养；（2）、接种培养a、在器皿底部放入纱布或者毛巾，将150mg/L的卡那霉素溶液倒入器皿且湿透纱布或毛巾为宜，同时将已经灭菌处理的棉花种子接种到器皿中，在卡那霉素浸种萌发培养，光照培养或暗培养均可，培养温度28℃，培养时间，去种皮接种培养2天，直接放入培养不去种皮接种培养4天；b、培养结束后，下胚轴生长较快的种子，测量伸长在2.3cm以上即为含有Bt抗虫基因的种子，作为育种资源利用的后代材料，不伸长或稍微伸长，则为不含有Bt抗虫基因的种子，是育种中应当放弃的材料。本专利技术方法设计合理，把棉花转基因技术和种子发芽技术进行有机结合，对转基因抗虫棉杂交后代种质材料进行鉴别分离，去伪存真，简便、快速、高效地从转基因抗虫棉杂交后代种子中筛选出阳性转基因植株或株系，直接即可进行播种，减免了田间卡那霉素涂抹鉴定这一繁琐程序，提高育种工作的效率，缩短育种周期，具有很好的推广应用价值。具体实施方式下面对本专利技术的具体实施例进行详细说明。一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法，包括如下步骤：（1）、材料准备经农杆菌介导获得的转基因棉花植株。通过杂交产生的后代种子，种子经硫酸脱绒后，用70%酒精浸泡2s，再放入10%过氧化氢表面消毒进行灭菌处理，或者直接经0.1%的氯化汞浸泡5~7min进行灭菌处理，然后用无菌水冲洗，浸泡于三角瓶中，封口，在20～30℃下经过24h以上，待种子萌动后，去种皮接种或直接放入培养后续制备的器皿中培养。条件许可，实验室采取经高温灭菌的培养皿，农户、农场或无实验条件时采用蒸煮过的盘碟等，在其底部铺两层高温灭菌或蒸煮过的纱布或毛巾一层。（2）、接种培养将150mg/L的卡那霉素溶液倒入培养皿或盘碟且湿透纱布或毛巾为宜，同时将已经灭菌处理的棉花种子接种到培养皿或碗碟中，在卡那霉素浸种萌发培养，盘碟加盘碟为盖，保持水分，光照培养或暗培养都可以，器皿大小以需检测种子多少为根据准备，培养温度28℃。培养时间，去种皮接种培养需要2天，直接放入培养不去种皮接种需要4天。因为在导入的外源基因构建中，NPTⅡ基因（卡那霉素标记基因）与Bt抗虫基因紧密连锁，因此含有NPTⅡ基因（卡那霉素标记基因）的检测材料会在150mg/L的卡那霉素基质上生长伸长，伸长的种子也就包含着Bt抗虫基因，具有抗棉铃虫的生物特性，反之则相反，培养结束后，下胚轴生长较快的种子，测量伸长大在2.3cm以上即为含有Bt抗虫基因的，可以作为育种资源利用的后代材料，不伸长或稍微伸长，则为不含有Bt抗虫基因的种子，是育种中应当放弃的材料。对比验证如下：为证明本专利技术方法对于转基因抗虫棉杂交后代种质材料鉴别筛选的可靠性，针对实验材料作了PCR检测对比，共对本专利技术方法鉴别出的筛选36株阳性、28株阴性单株进行PCR检测，分别提取经本专利技术方法筛选后的转基因阳性和阴性棉花幼苗叶片DNA进行PCR扩增电泳。结果显示，使用本专利技术技术对转基因抗虫棉杂交后代材料筛选出来的36株转基因抗虫阳性棉花幼苗的叶片经PCR检测基本上全为阳性，28株转基因抗虫阴性棉花幼苗的叶片经PCR检测也基本上全为阳阴性，结果一致。这就为本专利技术这一套快速、简单，因地制宜的技术方法，奠定了理论基础和实验依据。具体利用：配合育种的计划周期，结合播种时间安排，将通过本方法筛选出来的，萌发伸长在2.3cm以上的种子，直接开沟播种于实验区域或大田继续发育生长。不会影响带抗虫特性且表现优异的后代材料的进一步配比选育，相比田间叶片涂抹卡那霉素法，本专利技术方法不仅可以更准确地控制假阳性，而且对后代的鉴别确定大约能提早4-5个月的棉花生长期，为下一步的育种工作提前做好准备。同时，与室内PCR法相比，不需要许多实验仪器和较为复杂的分子生物学实验操作，该方法操作简单，成本低廉，而且能够在播种的同时进行筛选与鉴定。不但节省了检测成本，缩短了检测时间，使后续其它途径的验证更加具有针对性。为下一代育种材料做好准备工作，减少了田间卡那霉素涂抹，鉴定和筛选抗虫后代的环节，提高育种工作的效率，缩短本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）、材料准备经农杆菌介导获得的转基因棉花植株，通过杂交产生的后代种子，种子经硫酸脱绒，经灭菌处理后，浸泡于容器中，封口，在20～30℃下经过24h以上，待种子萌动后，去种皮接种或直接放入培养后续制备的器皿中培养；（2）、接种培养a、在器皿底部放入纱布或者毛巾，将150mg/L的卡那霉素溶液倒入器皿且湿透纱布或毛巾为宜，同时将已经灭菌处理的棉花种子接种到器皿中，在卡那霉素浸种萌发培养，光照培养或暗培养均可，培养温度28℃，培养时间，去种皮接种培养2天，直接放入培养不去种皮接种培养4天；b、培养结束后，下胚轴生长较快的种子，测量伸长在2.3cm以上即为含有Bt抗虫基因的种子，作为育种资源利用的后代材料，不伸长或稍微伸长，则为不含有Bt抗虫基因的种子，是育种中应当放弃的材料。

【技术特征摘要】
1.一种转基因抗虫棉杂交后代种质材料的高效鉴别及利用方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）、材料准备经农杆菌介导获得的转基因棉花植株，通过杂交产生的后代种子，种子经硫酸脱绒，经灭菌处理后，浸泡于容器中，封口，在20～30℃下经过24h以上，待种子萌动后，去种皮接种或直接放入培养后续制备的器皿中培养；（2）、接种培养a、在器皿底部放入纱布或者毛巾，将150mg/L的卡那霉素溶液倒入器皿且湿透纱布或毛巾为宜，同时将已经灭菌处理的棉花种子接种到器皿中，在卡那霉素浸种萌发培养，光照培养或暗培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊侠，孙振纲，陈耕，郭海莉，夏芝，朱永红，潘转霞，胡晓丽，
申请(专利权)人：山西省农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：山西,14