一种用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌双元表达载体及其构建方法技术

本发明专利技术公开了一种含有酿酒酵母

【技术实现步骤摘要】
一种用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌双元表达载体及其构建方法
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌双元表达载体的构建。
技术介绍
近年来随着传统化石燃料的临近枯竭，加之环境问题也日益突出，致使生物能源越来越得到广泛的关注，以微藻产油为代表的微藻生物燃料的生产，尤其受到各国科学家的重视。因此利用现代生物技术强化微藻脂质代谢途径、增加微藻的含油量、增加富油微藻生物量的累积，来提高微藻产油的竞争力成为时下的热点。其中莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是微藻研究中的模式藻，是研究油脂代谢基因的理想受体藻株。莱茵衣藻的油脂合成途径中，甘油三酯（TAG）是油脂的主要成分，代谢途径中TAG含量的多少取决于其前体物质甘油-3-磷酸(G-3-P)的积累，关键酶甘油-3-磷酸脱氢酶（GPDH）调控G-3-P的正向合成，直接影响TAG含量多少。Vigeolas等在Brassicanapuscv.中重组表达酵母菌甘油3-磷酸酰基转移酶基因（gpd1）基因，致使种子的含油量增加40%，证实了gpd1基因对于TAG合成的关键作用。现有技术中存在使用外源gpd1基因提高莱茵衣藻TAG含量的技术，但其是在细胞壁缺陷型莱茵衣藻株系中使用珠磨法转化表达外源gpd1基因，细胞壁缺陷型藻株需要经过人为改造，费时费力。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术需要细胞壁缺陷型藻株的缺点，通过构建用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌双元表达载体，使用农杆菌介导法转化野生型莱茵衣藻，以提高莱茵衣藻的含油量。本专利技术实现过程如下：一种含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体，所述载体的构建方法包括以下步骤：（1）gpd1基因为序列表中SEQIDNo.3所示DNA分子，来自酿酒酵母的基因组，通过嵌套PCR得到，并在基因两端添加EcoRI和NdeI酶切位点，其引物序列为序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的DNA分子；（2）将PCR扩增后的反应液和载体pDBle用NdeI和EcoRI双酶切，并将得到的酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆扩大培养，提取质粒双酶切验证，将阳性重组质粒命名为重组质粒pDBle-GPD1；（3）将pDBle-GPD1与pRI101-AN质粒使用BamHI和KpnI双酶切，回收连接，热激转化DH5α的感受态细胞，Amp（100mg/L）抗性的LB平板筛选培养，阳性重组质粒命名为pRI101-GPD1。所述双元表达载体为pRI101-GPD1。上述含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体的遗传转化方法，包括以下步骤：（1）制备农杆菌LBA4404感受态，然后将重组质粒pRI101-GPD1通过冻融法转化到根癌农杆菌，得到含有gpd1基因的根癌农杆菌LBA4404；（2）将获得的阳性农杆菌LBA4404侵染莱茵衣藻FACHB479获得转gpd1基因莱茵衣藻；（3）提取莱茵衣藻基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因植株；（4）选择莱茵衣藻转化株，使用改良的尼罗红染色法经多功能酶标仪进行油脂含量鉴定，并在激光共聚焦显微镜下观察油脂染色情况。上述的双元表达载体在携带外源gpd1基因进入野生型具有细胞壁的莱茵衣藻基因组中的应用，利用携带双元表达载体的农杆菌LBA44044侵染野生型具有细胞壁的莱茵衣藻FACHB-479，在乙酰丁香酮的作用下将目的基因转入莱茵衣藻FACHB-479的基因组中，并用PCR、RT-PCR和尼罗红染色法验证。本专利技术以具有细胞壁的野生型莱茵衣藻FACHB479作为受体细胞，成功构建了用于转化莱茵衣藻的gpd1基因农杆菌双元表达载体。这不仅可以节省构建细胞壁缺陷型藻株的人力物力，而且可以对因为没有数据库而无法构建细胞壁缺陷型的其他微藻的转基因方法具有一定的启发，为将来高产油转基因微藻的研究提供了一些思路。附图说明图1是双元载体构建图；图2是gpd1基因套嵌PCR分析图,A第一次PCR，B第二次PCR，M2kbMarker;图3是pMD-GPD1鉴定图，APCR；BNdeI和EcoRI双酶切:M5kbMarker,1空白对照,2pMD-GPD1；图4是质粒pMD-GPD1的gpd1测序比对图；图5是质粒pDBle-GPD1双酶切验证图，M15kbMarker,1-2pDBle-GPD1；图6是质粒pRI101-GPD1双酶切验证图，M15kbMarker,1-2pRI-Ble-GPD1；图7是质粒pRI101-GPD1的gpd1测序比对图；图8是转化藻株在Ble抗性TAP上的培养图，1：野生型FACHB-479，2：FACHB-GPD1，3：空载体PRI101-AN转化藻FACHB-479；图9是不同藻株中gpd1基因的分子生物学分析图；A：PCR，B：RT-PCRM:5kbMarker,1：阴性对照（无模板）,2：阳性对照,3：野生型FACHB-479,4-12：转化藻株；图10是藻细胞激光共聚焦图；图11是不同藻株油脂含量测定图。具体实施方式1．gpd1基因莱茵衣藻双元表达载体pRI101-GPD1的构建方法根据gpd1基因序列（NCBIGenBank登录号为NC_001136.10），在上下游增加酶切位点，用Oligo7软件设计引物，序列为序列表中序列1和序列2，由公司合成。试剂盒法提取酿酒酵母DNA，采用嵌套PCR方法扩增gpd1。PCR体系为20μL，含有上下游引物终浓度各0.5μmol/L，dNTPs终浓度为125μmol/L，10×PyrobestBuffer2μL，PyrobestDNAPolymerase1U。扩增程序为94℃10min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，进行30个循环，72℃10min。1%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，回收gpd1基因，电泳结果显示扩增出1175bp的DNA片段（图2）。gpd1的3’端加碱基A连接到载体pMD18-T，热激转入DH5α感受态细胞，涂于附加有100mg/LAmp的LB平板，37℃培养出单菌落，再液体培养过夜。gpd1片段的PCR扩增结果（图3）以及NdeI和EcoRI双酶切结果（图3）均可以得到1175bp的预期电泳条带，公司测序验证（图4）重组质粒pMD-GPD1中的gpd1序列与酿酒酵母gpd1基因（NCBIGenBank登录号NC_001136.10）100%吻合。。用NdeI和EcoRI酶37℃4h分别酶切质粒pMD-GPD1和pDBle，回收产物连接，热激转化DH5α感受态细胞，在Amp（100mg/L）抗性的LB平板培养。阳性单菌落酶切鉴定为重组质粒pDBle-GPD1。经验证，质粒pDBle-GPD1通过NdeI和EcoRI双酶切可以得到1175bp的预期条带（图5）。进行pDBle-GPD1与pRI101-AN质粒的BamHI和KpnI37℃2h酶切，回收连接，热激转化DH5α的感受态细胞，Amp（100mg/L）抗性的LB平板筛选培养，阳性单菌落酶切鉴定命名为pRI101-GPD1，构建成功的质粒pRI101-GPD1，用BamHI和KpnⅠ进行双酶切得到4930bp条带（图6）。2．pRI10本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有酿酒酵母

【技术特征摘要】
1.一种含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体，其特征在于，所述载体的构建方法包括以下步骤：（1）gpd1基因为序列表中SEQIDNo.3所示DNA分子，来自酿酒酵母的基因组，通过嵌套PCR得到，并在基因两端添加EcoRI和NdeI酶切位点，其引物序列为序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的DNA分子；（2）将PCR扩增后的反应液和载体pDBle用NdeI和EcoRI双酶切，并将得到的酶切产物用T4DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取单克隆扩大培养，提取质粒双酶切验证，将阳性重组质粒命名为重组质粒pDBle-GPD1；（3）将pDBle-GPD1与pRI101-AN质粒使用BamHI和KpnI双酶切，回收连接，热激转化DH5α的感受态细胞，Amp（100mg/L）抗性的LB平板筛选培养，阳性重组质粒命名为pRI101-GPD1。2.根据权利要求1所述的含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体，其特征在于，所述双元表达载体为pRI101-GPD1。3.权利要求1所述含有酿酒酵母gpd1基因的双元表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）gpd1基因为序列表中SEQIDNo.3所示DNA分子，来自酿酒酵母的基因组，通过嵌套PCR得到，并在基因两端添加EcoRI和NdeI酶切位点，其引物序列为序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示的DNA分子；（2）将PCR扩增后的反应液和载体pDBle用NdeI和EcoRI双...

【专利技术属性】
技术研发人员：王英娟，杨泽熵，张雨靖，高文英，吕亚维，
申请(专利权)人：西北大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61