本发明专利技术涉及转基因玉米，具体公开了一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法。本发明专利技术利用玉米茎尖作为受体不受基因型的限制，还开发了一套严格适用于玉米茎尖作为转化受体的培养基体系，实现玉米的高效遗传转化。本发明专利技术所述方法缩短了玉米的转化周期，以茎尖作为受体不受基因型的限制，还可以免除转基因过程中的植株再生等环节。突破了转化外植体的限制，提高了玉米的转化效率。该方法操作简便，简单易行，转化周期短，转化效率高，结果可靠，能够快速获取转基因玉米植株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及转基因玉米，具体地说，涉及一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化 方法。
技术介绍
玉米在我国的栽培历史大约有470多年。目前我国播种面积在3亿亩左右，仅次 于稻、麦，在粮食作物中居第三位，在世界上仅次于美国。玉米主要用作食量、饲料、能源、 营养品以及医药工业的原料，其工业价值广泛用于造纸、食品、纺织、医药等行业，具有产量 高、耐储存、再生产价值高的特点。 截止至2014年，转基因作物种植面积从1996年的170万公顷增长到2014年的 1. 815亿公顷，其中耐除草剂转基因玉米种植面积在800万公顷左右，抗虫转基因种植面积 为600万公顷（中国生物技术信息网）。这一增长使得转基因技术以可观的利润成为现代 农业史上应用最迅速的作物技术。转基因作物不仅对粮食安全做出了巨大贡献，在可持续 性和气候变化等方面也有诸多贡献。 虽然玉米转基因技术的应用取得了巨大进展，但是仍然存在着很多问题。重要一 点在于组织培养技术还不是很成熟，很大的抑制转化的成功，毕竟现在多数转化方法都是 以植物组织培养为基础。自1975年以来已经从包括玉米幼胚、未成熟花序、小抱子、胚叶、 雌雄幼穗等多种外植体诱导出愈伤组织。但是由于玉米品系众多、遗传背景复杂、离体培养 影响因子多且相互作用等因素的影响，仍存在玉米组织培养愈伤诱导率低、质量不稳定、实 验重复性差、再生植株成活率低等多重困难。现如今玉米的转化大多数采用转化幼胚的方 法，而幼胚长度又和基因型及采样季节有很大关系。一般早熟品种授粉后幼胚生长较快。 晚熟品种生长较慢；夏季高温季节授粉后幼胚生长较快，秋季温度较低时幼胚生长较慢。因 此，采样时间要根据基因型、生长季节和幼胚大小来决定。基因型仍是幼胚培养的主要限制 因素。 如公开号为CN1263949的中国专利申请，公开了一种建立玉米转基因受体体系的 方法及应用。将玉米茎尖接种在附加不同激素组合的诱导培养基上，诱导茎尖培养物直接 产生丛生芽或丛生芽组织块。取继代培养后处于旺盛生长期的丛生芽和丛生芽组织块为受 体，采用农杆菌介导法、基因枪轰击法等将外源基因转入培养细胞，经过恢复、筛选等步骤 获得转基因植株。但是，利用茎尖分化的丛生芽作为外植体仍需要长期的诱导、继代、分化 等培养过程，培养周期较长的缺点制约着玉米遗传转化的研究进展。 再如公开号为CN102304544A的中国专利申请，公开了一种根癌农杆菌介导的大 麦茎尖转化方法，其步骤:A.大麦茎尖培养及载体构建：1)选取大麦颖果，去除稃片，剥取 成熟胚，盾片向下放置在萌发培养基上萌发；2)从中间载体pMBL-3及和绿色荧光蛋白基因 GFP用酶切和PCR方法获得玉米泛素启动子及相关序列；B、利用农杆菌介导大麦茎尖遗传 转化，步骤：1)大麦茎尖的获取；2)茎尖的浸染；3)茎尖和农杆菌LBA4401共培养培养基： 取出经农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液；4)茎尖的恢复培养基；5)茎尖的 筛选培养基；6)再生植株的春化和栽培，得到候选的转化植株。方法易行，操作简便，周期 短、效率高，程序简单，操作方便，结果可靠。但是，大麦与玉米虽都为单子叶植物，但大麦与 玉米作为两种不同的作物也决定了在转化上的差异，而目前未见适用于玉米的技术方案。 目前，玉米遗传转化方法主要采用农杆菌介导法和基因枪法，其受体主要是幼胚 和胚性愈伤组织，而愈伤组织形成的再生植株无性系变异大、周期长等缺点也制约着玉米 遗传转化研究的发展。 因此，选择合适的外植体作为玉米遗传转化的受体，高效的遗传转化体系是转基 因研究的重要环节。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种农杆菌介导的玉米成 熟胚茎尖转化方法。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下： 本专利技术首先提供，包括如下步骤： A、玉米茎尖培养及载体构建： 1)挑选饱满无损伤的种子，进行消毒处理后，取成熟胚放于萌发培养基上，在培养 箱中经过低温处理，再置于23-28Γ暗培养进行萌发； 2)构建携带目的基因的植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆 菌； B、利用农杆菌介导玉米成熟胚茎尖遗传转化： 1)玉米成熟胚茎尖的获取： 待胚芽长到3-5cm时，在芽节点上方l-2mm的位置横切第一刀，将胚芽结上部切掉 丢弃，得到茎尖，在茎尖切口处的中央部位向下纵切第二刀，切口稍越过结的下线约1_，用 刺针刺伤横切面生长点上端，在高渗培养基中放置lh以上； 2)茎尖的侵染： 从步骤1)得到的玉米成熟胚茎尖，加入用根癌农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农 杆菌LBA4401菌液，浸染茎尖4-6min; 3)茎尖和根癌农杆菌的共培养： 取出经根癌农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于共培养固体培养 基上在24-28 °C共培养3d; 4)茎尖的恢复培养： 将步骤3)中的茎尖转至恢复培养基，于22-24Γ下培养至从生长点部位萌生出新 的幼叶； 5)转化苗的转苗及栽苗： 将长出新叶的幼苗从恢复培养基中取出，洗掉多余的恢复培养基，栽入花盆中，在 人工气候箱中光照培养，等叶片伸展后移栽到温室大棚中； 6)对伸展出新生叶的幼苗进行抗性筛选： 幼苗长到两叶一心时，用除草剂处理新生叶片，除草剂的喷施根据苗情来判断，筛 选抗性幼苗，将正常生长的玉米幼苗连根挖出移栽入大田；所述萌发培养基为：33000mg/L NH4N03,38 0 00mg/L KN03,88 00mg/L CaCl2 · 2H20， 7400mg/L MgS04.7H20,3400mg/L KH2P04,4400mg/L MnS04.4H20,800mg/L H2B03，1600mg/ L KI，1600mg/L ZnS04 · 7H20,4. 88 5mg/L氯化胆碱，2. 445mg/L核黄素，5. 008mg/L生物素， 2. 425mg/L叶酸，9. 97mg/L烟酸，23. 611mg/L维生素BI，5. Omg/L D-泛酸钙，9. 97mg/L盐酸 吡哆辛，〇·〇〇675mg/L维生素B12, 2. 47mg/L对氨基甲苯，7. 46mg/L Na2EDTA.2H20, 5. 56mg/L FeS04. 7H20, 500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL-脯氨酸，30000mg/L鹿糖，5000mg/L葡萄糖， 100mg/L肌醇，8000mg/L琼脂粉pH 5. 8 ;所述高渗培养基：56600mg/L KN03,9 2 60mg/L NH4S04,3 7 00mg/L MgS04 7H20， 8000mg/LKH2P04,33200mg/LCaCl. 2H20, lOOmg/L MnS04 4H20,20mg/L ZnS04.7H20,0· 25mg/L CoCl2 6H20,0· 25mg/L CuS04 5H20, 2. 5mg/L NaMo04 2H20,4. 885mg/L氯化胆碱，2. 445mg/L核 黄素，5. 008mg/L生物素，2. 425mg/L叶酸，9. 97mg/L烟酸，23. 611mg/L维生素BI，5. Omg/L D-泛酸钙，9. 97mg/L盐酸吡哆辛，0· 00675mg/L维生素B12, 2. 47m本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种农杆菌介导的玉米成熟胚茎尖转化方法，其特征在于，包括如下步骤：A、玉米茎尖培养及载体构建：1)挑选饱满无损伤的种子，进行消毒处理后，取成熟胚放于萌发培养基上，在培养箱中经过低温处理，再置于23‑28℃暗培养进行萌发；2)构建携带目的基因的植物表达载体，将构建好的植物表达载体转化根癌农杆菌；B、利用农杆菌介导玉米成熟胚茎尖遗传转化：1)玉米成熟胚茎尖的获取：待胚芽长到3‑5cm时，在芽节点上方1‑2mm的位置横切第一刀，将胚芽结上部切掉丢弃，得到茎尖，在茎尖切口处的中央部位向下纵切第二刀，切口稍越过结的下线约1mm，用刺针刺伤横切面生长点上端，在高渗培养基中放置1h以上；2)茎尖的侵染：从步骤1)得到的玉米成熟胚茎尖，加入用根癌农杆菌浸染培养基悬浮的根癌农杆菌LBA4401菌液，浸染茎尖4‑6min；3)茎尖和根癌农杆菌的共培养：取出经根癌农杆菌浸染的茎尖，在无菌滤纸上吸干表层菌液，于共培养固体培养基上在24‑28℃共培养3d；4)茎尖的恢复培养：将步骤3)中的茎尖转至恢复培养基，于22‑24℃下培养至从生长点部位萌生出新的幼叶；5)转化苗的转苗及栽苗：将长出新叶的幼苗从恢复培养基中取出，洗掉多余的恢复培养基，栽入花盆中，在人工气候箱中光照培养，等叶片伸展后移栽到温室大棚中；6)对伸展出新生叶的幼苗进行抗性筛选：幼苗长到两叶一心时，用除草剂处理新生叶片，除草剂的喷施根据苗情来判断，筛选抗性幼苗，将正常生长的玉米幼苗连根挖出移栽入大田；常规方法在转苗前惊醒筛选培养，而成熟胚茎尖转化是转化的生长点，所以幼苗长到两叶一心时，才能用除草剂处理新生叶片。所述萌发培养基为：33000mg/L NH4NO3，38000mg/L KNO3，8800mg/L CaCl2·2H20，7400mg/L MgSO4·7H20，3400mg/L KH2PO4，4400mg/L MnS04·4H20，800mg/L H2BO3，1600mg/L KI，1600mg/L ZnSO4·7H20，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/L D‑泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/L Na2EDTA.2H2O，5.56mg/L FeSO4.7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL‑脯氨酸，30000mg/L蔗糖，5000mg/L葡萄糖，100mg/L肌醇，8000mg/L琼脂粉pH 5.8；所述高渗培养基：56600mg/L KNO3，9260mg/L NH4SO4，3700mg/L MgSO4·7H2O，8000mg/LKH2PO4，33200mg/LCaCl·2H2O，100mg/L MnSO4·4H2O，20mg/L ZnSO4·7H2O，0·25mg/L CoCl2·6H2O，0.25mg/L CuSO4·5H2O，2.5mg/L NaMoO4·2H2O，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/L D‑泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/L Na2EDTA·2H2O，5.56mg/L FeSO4·7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/L L‑脯氨酸，20000mg/L蔗糖，10000mg/L葡萄糖pH 5.8；所述浸染培养基为：56600mg/L KNO3，9260mg/L NH4SO4，3700mg/LMgSO4·7H2O，8000mg/LKH2PO4，33200mg/LCaCl·2H2O，100mg/LMnSO4.4H2O，20mg/LZnSO4·7H2O，0.25mg/LCoCl2·6H2O，0.25mg/LCuSO4·5H2O，2.5mg/LNaMoO4·2H2O，4.885mg/L氯化胆碱，2.445mg/L核黄素，5.008mg/L生物素，2.425mg/L叶酸，9.97mg/L烟酸，23.611mg/L维生素BI，5.0mg/L D‑泛酸钙，9.97mg/L盐酸吡哆辛，0.00675mg/L维生素B12，2.47mg/L对氨基甲苯，7.46mg/L Na2EDTA·2H2O，5.56mg/L FeSO4·7H2O，500mg/L酪蛋白水解物，700mg/LL‑脯氨酸，20000mg/L蔗糖，10000mg/L葡萄糖，100uM乙酰丁香酮pH 5.8；所述共培养固体培养基为：33000mg/L NH4NO3...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：康定明，刘永健，曹金伶，张少蔓，赵传森，严慧慧，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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