本发明专利技术提供了一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的转基因方法，包括（a）浸泡大豆，光照保湿条件下培养至下胚轴长2～3cm；（b）将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素KT、植物生长素2,4-D、抗氧化剂DTT和L-Cysteine；（c）在渗透培养基中，用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口；（d）致伤处理后的大豆幼苗浸没在渗透培养基中培养；（e）农杆菌侵染后的大豆幼苗在吸水纸上吸干水分，种入土中。该方法是一种无需经过组织培养阶段的农杆菌介导的大豆转化方法，具有比较高的实际应用价值和推广前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种农杆菌介导的利用纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的方法。
技术介绍
大豆是重要的的食用和油料作物。大豆含丰富的植物蛋白，营养价值极高。大豆油中不饱和脂肪酸和维生素E含量丰富，是世界上最重要的植物油。随着世界人口的增长及人们生活水平的提高，人们对大豆的需求量越来越大。常规育种已不能满足人们对大豆品种和品质的要求。随着现代分子生物学的发展和进步，利用转基因技术培育大豆新品种已经成为一种趋势。将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术。目前用于大豆育种的转基因技术主要包括两大类，第一类是不需要经过组织培养的转基因技术，目前研究比较多的是花粉管通道法；另一类是需要经过组织培养的转基因技术，比较常用的有基因枪法和农杆菌介导法。(一)花粉管通道法花粉管通道法是在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为携带转基因的新个体。花粉管通道法不需要组织培养和仪器转化设备，简便易行，但需要育种工作者摸索具体的外源DNA导入时间与方法。(二)基因枪法基因枪法是将直径很小的钨粉或金粉粒子微粒浸泡在供体DNA中，使外源基因吸附在表面，然后用基因枪以很高的速度将金属微粒射入受体植物细胞内实施转化。该方法的主要优点是不受受体植物范围的限制，其载体质粒的构建也相对简单，因此也是目前转基因研究中应用较为广泛的一种方法。但是基因枪法需要经过组织培养阶段，受到组织培养条件的限制，转基因周期长，成本比较高。另一方面由于基因枪法的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象的发生，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。 而且基因枪价格昂贵、运转费用高。这些都限制了基因枪作为产业化转基因技术的广泛使用。(三)农杆菌介导法农杆菌介导法是现代转基因领域广泛使用的一种技术，其优点是手段相对简单，可靠性强，效率高。但在只有外植体能再生的双子叶植物中才能采用。目前，农杆菌介导法应用于大豆转化主要是以大豆的子叶、子叶节等为外植体，利用农杆菌侵染，然后经过组织培养再生器官，获得转基因苗。大豆转化的效率受到农杆菌菌株感染转化能力、大豆基因型、 组织培养条件、T - DNA的转移效率和转化后的筛选模式的影响，很难大面积推广。本专利技术提供了一种全新的、无需经过组织培养阶段的农杆菌介导的大豆转化方法，具有比较高的实际应用价值和推广前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的转基因方法，包括以下步骤(a)、浸泡大豆，光照保湿条件下培养至下胚轴长2 3cm。(b)、将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素KT、植物生长素2，4-D、抗氧化剂DTT和L-Cysteine。(C)、在渗透培养基中，用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口。(d)、致伤处理后的大豆幼苗浸没在渗透培养基中培养。(e)、农杆菌侵染后的大豆幼苗在吸水纸上吸干水分，种入土中。使用纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆时，会导致大部分植株发生褐变腐烂死亡的现象，严重影响了植株生长及结实率与转化率。这种外植体的褐化可能是植物对受伤和病原体侵害的一种防御反应。我们在渗透培养基里添加了 DTT和L-Cysteine，这两种抗氧化剂可以有效的减少外植体的褐化现象，提高农杆菌的感染率。本专利技术还首次在渗透培养基里添加了生长素2，4-D和激动素(KT)，这两种添加剂能够显著提高大豆的转化效率。本专利技术中，上述渗透培养基中2，4-D的最佳浓度为0. 5_5mg/L、KT的最佳浓度为 0. l-4mg/L, DTT 的最佳浓度为 0. 5_5mM/L、L-Cysteine 的最佳浓度为 100 400mg/L。本专利技术中用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口，具体为顺大豆两子叶夹缝，划伤上胚轴顶端外侧，使夹缝向胚轴方向延长，优选延长4 6mm。致伤后的大豆在渗透培养基中^°C、24hr黑暗、130 170rpm培养15 30min。本专利技术含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入表达载体，再将该载体导入农杆菌中。常用的表达载体包括但不限于=PBin系列载体、pBI系列在、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体；常用的农杆菌菌株包括但不限于AGL0、AGLU GV3101、EHA105、 LBA4404 等。本专利技术的方法与其它大豆转基因方法的显著区别在于采用大豆上胚轴顶端作为农杆菌介导的外植体，而不是胚性愈伤或悬浮细胞，避免了组织培养和植株再生的过程，克服了由于大豆基因型对转化后植株再生的局限，同时极大简化了大豆转基因操作的流程， 具有比较高的实际应用价值和推广前景。下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术，而不构成对专利技术范围的限制。 附图说明图1为TO代转基因大豆草胺磷涂抹实验筛选结果示图，其中A图为野生型，B图为转基因阳性植株。红色圆圈为草胺磷涂抹的叶片部位。图2为Tl代转基因大豆草胺磷喷洒实验筛选结果示图，其中A图为野生型，B图为转基因阳性植株。图3为Tl代转基因大豆的PCR检测结果，其中泳道M为marker，+是以质粒为模板的正对照，-为野生型负对照，1 10为检测的10个转基因大豆。图4为Tl代转基因大豆的southern检测结果，其中泳道1 5为转基因大豆，+为质粒的正对照。 具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见 《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 (Sambrook， J. ， Russell, David W.， Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。 所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。实施例一、纵切上胚轴顶端转化大豆 1.实验材料质粒含有bar基因，带有潮霉素筛选标记基因的pCambial300-bar载体，具有抗草铵磷除草剂。PCR扩增bar基因连接到pcambial300 (购自hvitrogen公司)载体上得到 pcambial300-bar i^f 本。农杆菌菌株AGL0。供转化的大豆品种黑农37号，华疆4号。2.农杆菌的培养挑取甘油冻存的含有目的基因的农杆菌，于YEB平板上画线，黑暗培养箱培养2 天。挑取单菌落接种于40ml抗性YEB液体培养基中黑暗摇床200rpm摇过夜，至 OD600 1。吸取上述培养物250 300 μ 1涂布于平板直径为15cm的YEB固体培养基上， 黑暗培养箱培养2天后，此备用的新鲜平板当天使用，约20°C室温黑暗待用，不要继续存留于黑暗培养箱或转存于4°C冰箱。3.渗透培养基的制备首先按照下述配方配制AA培养基。AA培养基配制(IL) MgSO40. 12209g KCl 2.95g NaH2PO4 · 2H20 0. 15g 肌醇 0. Ig 谷氨酸 0.876g 天门冬氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种农杆菌介导的纵切幼苗上胚轴顶端转化大豆的转基因方法，包括以下步骤：（ａ）浸泡大豆，光照保湿条件下培养至下胚轴长２～３ｃｍ；（ｂ）将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有细胞分裂素ＫＴ、植物生长素２，４－Ｄ、抗氧化剂ＤＴＴ和Ｌ－Ｃｙｓｔｅｉｎｅ；（ｃ）在渗透培养基中，用薄刀刃在大豆的上胚轴顶端纵切，制造伤口；（ｄ）致伤处理后的大豆幼苗浸没在渗透培养基中培养；（ｅ）农杆菌侵染后的大豆幼苗在吸水纸上吸干水分，种入土中。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何峰，张会新，孔祥凤，夏勉，张斌，郑辰，
申请(专利权)人：北京未名凯拓作物设计中心有限公司，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。