本发明专利技术公开了一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是：A、诱导紫萍愈伤组织；B、目的基因与T载体连接；C、目的基因与植物表达载体连接；D、植物表达载体在根癌农杆菌LBA4404中的转化；E、制备侵染菌液；F、愈伤组织与农杆菌共培养；G、再生及选择培养：叶状体GUS染色结果呈蓝色表明目的基因成功整合入紫萍基因组中，且叶状体组织被染成蓝色的部位就是目的基因表达的部位。通过将目的基因插入植物表达载体后再转入根癌农杆菌LBA4404用于侵染愈伤组织，最后控制抗生素的浓度筛选出阳性植株，得到转基因紫萍，建立的转化体系经过紫萍无性繁殖仍可持续稳定遗传，具有生物安全性和开发应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学和基因工程
，具体涉及一种农杆菌介导的紫萍(Spirodelapolyrhiza)稳定转化体系建立的方法。紫萍稳定转化体系的建立为开发利用紫萍作为生物反应器生产蛋白(药用疫苗和抗体)，酶、糖类和脂类等次生代谢产物，以及通过过表达或抑制特定基因增强对高低温、盐、重金属、氮磷等耐受性用于生物修复奠定了基础。
技术介绍
自1983年世界上首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术得到了迅速发展，在世界范围内得到了广泛的应用，其巨大的生产潜力为人类带来很大的经济效益和社会效益。植物转基因技术主要应用于农业、生物和医学等领域，进行植物品种的改良、新品种的培育以及作为生物反应器等。植物转基因技术可高效、快速提高粮食作物、蔬菜、林木树种和花卉草种的产量、品质和抗耐性，培育高产、高抗、多抗(如抗病毒、抗虫、抗除草剂、抗寒、抗旱、抗盐碱等)、优质的新品种。转基因技术已在棉花、大豆、玉米等主要农作物上得到了很好的应用，对全球农业产生了深刻的影响。转基因技术可以把植物作为“生物反应器”，进行药物蛋白(疫苗、抗体等)、工业用酶、糖类、脂类等一些有益次生代谢产物的生产，具有成本低、周期短、效益高和安全性好的特点(朱彦涛等，2008)。此外，通过植物转化技术过表达或克隆超富集植物中的特定基因，获得高效去除环境中污染物的转基因植物，对于污染场地的植物修复应用具有非常大的潜力。浮萍(Duckweed)是一种世界性范围分布的水生单子叶植物，包括Spirodela,Landoltia，Lemna，Wolffiella和Wolffia5个属，共37个种(Landolt,1998；Lesetal.,2002；Appenrothetal.,2013)。浮萍个体微小(0.5-15mm)，结构简单，仅由叶状体和不定根(仅限Spirodela，Landoltia和Lemna)组成，无性繁殖速度快(Ziegleretal.,2015；Hill-manandCulley,1978)，富含淀粉(ReidandBieleski,1970；LandoltandKandeler,1987)，并能大量富集水体中的污染物(Bergmannetal.,2002；ReinholdandSaunders,2006)。紫萍(Spirodelapolyrhiza)属浮萍科的一种，广泛分布于池沼、稻田、水塘及静水的河面，中国只此一种。它具有繁殖快，生物量大，淀粉和蛋白含量高，快速富集水体氨氮，重金属等(杨凤岩等，2011)优点。此外，紫萍(Spirodelapolyrhiza)全基因组测序结果表明其基因组很小，仅为158Mbp，低于Landoltia(372–427Mbp)，Wolffiella(623–973Mbp)，Lemna(323–760Mbp)andWolffia(357–1881Mbp)(Wangetal.,2011；Bogetal.,2015)，紫萍的这些优势使其快速吸引人们的注意力，并广泛应用于生物反应器、水体环境修复，以及开发生物能源。基因转化是利用重组DNA的方法直接将目的基因导入到植物细胞，并在其中进行表达，人为地有目的地组合基因，改变生物的遗传性能，建立一种稳定的基因转化体系是开发利用转基因植物的基础。基因转化的方法，包括农杆菌介导法，DNA直接导入法，花粉管通道法，植物病毒介导法等。目前，大多数转基因是通过农杆菌介导法和基因枪法这两种方法获得的，其中农杆菌介导法具有单一位点整合，遗传稳定性好，以及外源基因拷贝数低的优势，在植物转化体系中占有优势。目前，浮萍科的许多物种都已建立其基因转化体系，如Spirodelapunctata(Edelmanetal.,1998)，Spirodelaoligorrhiza(Rivaletal.,2008；Vunshetal.,2007)，Lemnagibba(StompandRajbhandari,2000)，Lemnaminor(Gasdaskaetal.,2003)，andWolffiaarrhiza(Khvatkovetal.,2015)，而有关紫萍(Spirodelapolyrhiza)基因转化体系的建立尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种农杆菌介导的紫萍(Spirodelapolyrhiza)稳定转化体系建立的方法。通过将目的基因插入植物表达载体，再转化到根癌农杆菌LBA4404(购自上海迈其生物科技有限公司，以下相同)，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物愈伤组织细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，在选择培养过程中通过调节激素的比例诱导再生植株，同时控制抗生素的浓度筛选阳性植株，得到转基因紫萍，且建立的转化体系经过紫萍无性繁殖仍可持续稳定遗传。此方法操作简单，结果稳定可靠，具有生物安全性和开发应用价值。为了实现上述的目的，本专利技术采用如下技术方案：一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是：1、诱导紫萍愈伤组织：野生紫萍(采自武汉东湖)采用0.1％(w/v)氯化汞灭菌2-3分钟后，培养于1/2MS固体培养基中：1％(w/v，以下相同)蔗糖、0.6％(w/v，以下相同)琼脂、0.5mg/LTDZ、pH5.8，待长出芽后，转移至1/2MS液体培养基中：1％蔗糖、pH5.8，用作长期保存。取20-30片叶状体置于愈伤诱导培养基：1/2MS培养基、1％蔗糖、0.6％琼脂、5mg/L2,4-D、2mg/L6-BA、pH5.8，直至愈伤组织长出，期间每两周更换一次培养基，培养出的绿色松软的愈伤组织用于后续基因转化。2、目的基因与T载体连接：通过PCR扩增目的基因用于后续试验，20μL的PCR扩增体系(以下相同)包括：模板1μL(约50ng)，dNTPs0.2mM，引物0.5mM，EasyTaq酶0.2单位，10×buffer(含MgCl2)2μL，补水至20μL。根据具体情况设置PCR反应条件及循环参数。PCR产物检测方法(以下相同)为：取5-10μLPCR产物与1-2μL6×LoadingBuffer混匀后，经1.2％(w/v，以下相同)琼脂糖凝胶检测，溴化乙锭染色10-15min后，凝胶成像仪观察拍照。检测显示为目的基因条带正确，表明成功扩增获得目的基因DNA。购买Promega公司pGEM-Teasy载体连接试剂盒连接目的基因与pGEM-Teasyvector，步骤如下：(1)10μLPCR产物与pGEM-Teasyvector连接体系,包括：2×rapidligationbuffer5μL，pGEM-Teasyvector(50mg/μL)1μL，PCRproduct3μL，T4DNAligase1μL，反应体系于4℃过夜；(2)将(1)步骤过夜混合物转化到大肠杆菌(DH5α)(购自上海迈其生物科技有限公司，以下相同)，采用电转化(以下相同)的方法，具体步骤如下：①每50μL大肠杆菌(DH5α)电转感受态细胞中加入2μL(1)步骤过夜混合物，置于冰上10min，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min左右；②打开电转移，调节电压为2KV，将(1)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是：A、诱导紫萍愈伤组织：野生紫萍采用0.1％w/v氯化汞灭菌2‑3分钟后，培养于1/2MS固体培养基中：1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、0.5mg/L TDZ、pH 5.8，待长出芽后，转移至1/2MS液体培养基中：1％w/v蔗糖、pH5.8，用作长期保存；取20‑30片叶状体置于愈伤诱导培养基：1/2MS培养基、1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、5mg/L 2,4‑D、2mg/L 6‑BA、pH 5.8，诱导愈伤组织，期间每两周更换一次培养基，培养出的绿色松软的愈伤组织用于后续基因转化；B、目的基因与T载体连接：通过PCR扩增目的基因用于后续试验，20μL的PCR扩增体系，包括：模板1μL，dNTPs 0.2mM，引物0.5mM，Easy Taq酶0.2单位，10×buffer2μL，补水至20μL，PCR产物检测方法为：取5‑10μLPCR产物与1‑2μL 6×Loading Buffer混匀后，经1.2％w/v琼脂糖凝胶检测，溴化乙锭染色10‑15min后，凝胶成像仪观察拍照，检测显示为目的基因条带正确，表明成功扩增目的基因DNA；pGEM‑Teasy载体连接试剂盒连接目的基因与pGEM‑Teasy vector，步骤是：(1)10μL体系PCR产物与pGEM‑Teasy vector连接体系，包括：2×rapid ligation buffer 5μL，pGEM‑Teasy vector1μL，PCR product 3μL，T4DNA ligase 1μL，反应体系于4℃过夜；(2)将(1)步骤过夜混合物转化到大肠杆菌DH5α，采用电转化的方法，步骤是：①每50μL大肠杆菌DH5α电转感受态细胞中加入2μL(1)步骤过夜混合物混合物，置于冰上10min，电极杯也提前置于冰上预冷18‑22min；②打开电转移，调节电压为2KV，将(1)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μL SOC液体培养基：2％W/V胰蛋白胨，0.5％W/V酵母提取物，0.05％W/V NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl2，20mM葡萄糖，pH 7.0，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时；④准备8μL IPTG(100mg/mL)和40μLX‑gal(20mg/mL)涂布于添加100mg/L氨苄青霉素Ampicillin的固体LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L Nacl，6g/L琼脂，pH 7.0，将(3)步骤转化产物于12000rpm离心1min后去上清涂板，37℃过夜培养；⑤挑取3‑5个白斑单克隆置于5mL添加100mg/L氨苄青霉素Ampicillin的液体LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L Nacl，pH 7.0，摇菌过夜；⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒后于‑20℃保存，并进行PCR检测和测序分析；C、目的基因与植物表达载体连接：(1)选择植物表达载体种类，采用电转化的方法将植物表达载体转化至大肠杆菌DH5α进行扩增，步骤是：①每50μL大肠杆菌DH5α电转感受态细胞中加入2μL植物表达载体，置于冰上9‑11min，电极杯也提前置于冰上预冷18‑22min；②打开电转移，调节电压为2KV，将(1)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μL SOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时；④将上步转化产物于添加了50mg/L卡那霉素Kanamycin的固体LB培养基涂板，37℃过夜培养；⑤挑取3‑5个单克隆置于5mL液体LB摇菌；⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于‑20℃保存；(2)目的基因与植物表达载体连接：目的基因连接至植物表达载体的步骤与连接至T载体相同，步骤是：①根据选择的植物表达载体设计引物，在A步骤获得的目的基因两端加上酶切位点，PCR及电泳鉴定后产物切胶回收纯化，PCR检测；②使用相同的内切酶同时双酶切①步骤的目的基因和植物表达载体，反应体系为：1μLDNA或植物表达载体，1μL内切酶A，1μL内切酶A buffer，1μL内切酶B，1μL内切酶B buffer，补水至20μL，37℃培养至少4h；③将双酶切目的基因产物与双酶切植物表达载体连接，10μL反应体系为：2×rapid ligation buffer 5μL，酶切植物表达载体1μL，酶切目的基因3μL，T4DNA ligase 1μL，反应体系于4℃过夜；④将③步骤...
【技术特征摘要】
1.一种农杆菌介导的紫萍稳定转化体系建立的方法，其步骤是：A、诱导紫萍愈伤组织：野生紫萍采用0.1％w/v氯化汞灭菌2-3分钟后，培养于1/2MS固体培养基中：1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、0.5mg/LTDZ、pH5.8，待长出芽后，转移至1/2MS液体培养基中：1％w/v蔗糖、pH5.8，用作长期保存；取20-30片叶状体置于愈伤诱导培养基：1/2MS培养基、1％w/v蔗糖、0.6％w/v琼脂、5mg/L2,4-D、2mg/L6-BA、pH5.8，诱导愈伤组织，期间每两周更换一次培养基，培养出的绿色松软的愈伤组织用于后续基因转化；B、目的基因与T载体连接：通过PCR扩增目的基因用于后续试验，20μL的PCR扩增体系，包括：模板1μL，dNTPs0.2mM，引物0.5mM，EasyTaq酶0.2单位，10×buffer2μL，补水至20μL，PCR产物检测方法为：取5-10μLPCR产物与1-2μL6×LoadingBuffer混匀后，经1.2％w/v琼脂糖凝胶检测，溴化乙锭染色10-15min后，凝胶成像仪观察拍照，检测显示为目的基因条带正确，表明成功扩增目的基因DNA；pGEM-Teasy载体连接试剂盒连接目的基因与pGEM-Teasyvector，步骤是：(1)10μL体系PCR产物与pGEM-Teasyvector连接体系，包括：2×rapidligationbuffer5μL，pGEM-Teasyvector1μL，PCRproduct3μL，T4DNAligase1μL，反应体系于4℃过夜；(2)将(1)步骤过夜混合物转化到大肠杆菌DH5α，采用电转化的方法，步骤是：①每50μL大肠杆菌DH5α电转感受态细胞中加入2μL(1)步骤过夜混合物混合物，置于冰上10min，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min；②打开电转移，调节电压为2KV，将(1)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μLSOC液体培养基：2％W/V胰蛋白胨，0.5％W/V酵母提取物，0.05％W/VNaCl，2.5mMKCl，10mMMgCl2，20mM葡萄糖，pH7.0，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时；④准备8μLIPTG(100mg/mL)和40μLX-gal(20mg/mL)涂布于添加100mg/L
\t氨苄青霉素Ampicillin的固体LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNacl，6g/L琼脂，pH7.0，将(3)步骤转化产物于12000rpm离心1min后去上清涂板，37℃过夜培养；⑤挑取3-5个白斑单克隆置于5mL添加100mg/L氨苄青霉素Ampicillin的液体LB培养基：10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNacl，pH7.0，摇菌过夜；⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取菌液中的质粒后于-20℃保存，并进行PCR检测和测序分析；C、目的基因与植物表达载体连接：(1)选择植物表达载体种类，采用电转化的方法将植物表达载体转化至大肠杆菌DH5α进行扩增，步骤是：①每50μL大肠杆菌DH5α电转感受态细胞中加入2μL植物表达载体，置于冰上9-11min，电极杯也提前置于冰上预冷18-22min；②打开电转移，调节电压为2KV，将(1)步骤过夜混合物转移至预冷的电极杯底部，轻敲击电极杯；③将电极杯推入电转化仪，按一下pulse键，听到蜂鸣声后向电极杯中加入800μLSOC液体培养基，重悬细胞后转移至1.5mL灭菌离心管中，置于37℃，180rpm复苏一小时；④将上步转化产物于添加了50mg/L卡那霉素Kanamycin的固体LB培养基涂板，37℃过夜培养；⑤挑取3-5个单克隆置于5mL液体LB摇菌；⑥采用康为世纪质粒小提试剂盒提取质粒于-20℃保存；(2)目的基因与植物表达载体连接：目的基因连接至植物表达载体的步骤与连接至T载体相同，步骤是：①根据选择的植物表达载体设计引物，在A步骤获得的目的基因两端加上酶切位点，PCR及电泳鉴定后产物切胶回收纯化，PCR检测；②使用相同的内切酶同时双酶切①步骤的目的基因和植物表达载体，反应体系为：1μLDNA或植物表达载体，1μL内切酶A，1μL内切酶Abuffer，1μL内切酶B，1μL内切酶Bbuffer，补水至20μL，37℃培养至少4h；③将双酶切目的基因产物与双酶切植物表达载体连接，10μL反应体系为：2×rapidligationbuffer5μL，酶切植物表达载体1μL，酶切目的基因3μL，T4DNAligase1μL，反应体系于4℃过夜；④将③步骤过夜混合物电转化的方法转...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨晶晶，侯宏伟，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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