本发明专利技术涉及一种C型β‑葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的是一种酶活性显著提高的C型β‑葡萄糖苷酶突变体及其构建方法，属于生物工程技术领域；本发明专利技术将来源于台湾白蚁的β‑葡萄糖苷酶进行定点突变，将第170位的赖氨酸K分别变为丝氨酸S和色氨酸W，第182位的苯丙氨酸F变为甲硫氨酸M，第252位的氨基酸组氨酸H变为天冬酰胺N，分别表示为Glu1C‑K170S、Glu1C‑K170W、Glu1C‑F182M、Glu1C‑H252N；本发明专利技术所得到的突变体的酶活性与突变前相比分别提高了5.2倍、2.05倍、2.9倍、2.1倍；本发明专利技术所得四株C型β‑葡萄糖苷酶突变体的酶活都有了不同程度的提高，更适合于生物催化工艺的应用，为工业化应用提供了有利的基础，更能满足社会生产的要求，有广阔的市场前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种C型3 -葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的 是一种酶活性显著提高的C型3 -葡萄糖苷酶突变体及其构建方法，属于生物工程技术领 域。
技术介绍
C型，-葡萄糖苷酶（，-C-吡喃葡萄糖苷水解酶，E.C. 3. 2. 1. 21)是一类能水解 苷类和寡糖的糖苷键并释放非还原性末端葡糖残基的酶。这些酶普遍存在于所有领域的生 命体中，在古细菌、真细菌和真核生物中发挥多种功能和作用。包括微生物内的生物质转 换、动物体糖脂和外源性糖苷的降解、细胞壁寡糖的木质化和分解代谢、防御、植物激素结 合共轭激活作用、植物中气味释放以及植物-微生物和植物-昆虫相互作用等。 白蚁是自然界中纤维素的最主要消耗者，白蚁主要通过内源和外源纤维素酶的协 同作用分解纤维素，最终转化为葡萄糖。白蚁体内就是一个微型的生物发酵器，若能模拟白 蚁的纤维素酶降解系统，工业化纤维素-葡萄糖-酒精-燃料的生产体系必是解决当前环 境问题能源危机的一条重要途径。 至今，国内外对白蚁体内的内源性C型葡萄糖苷酶的研究已经逐步加深，目前 人们主要集中在对该酶进行结构功能研究，并通过改造获得高表达、高活性的0 -葡萄糖 苷酶用于工业经济应用（Zhang，etal.，2010)。目前已有的研究显示，该类纤维素水解 酶的催化效率较低、人工提取和表达的酶纯化难度较大，若能通过同源建模等手段进行理 性分子设计，对白蚁内源性葡萄糖苷酶蛋白的催化活性、稳定性、底物特异性、耐热性 和耐酸碱性等进行合理化改造，将使此类酶具有更大的应用前景，实现巨大工业经济价值。 Hsiao-linLee等人（Mutationsinthesubstrateentranceregionof3-glucosidase fromTrichodermareeseiimproveenzymeactivityandthermostability)已经在来源 于里氏木霉的0 -葡萄糖苷酶中研究了突变后的酶，获得了一些活性增强的突变体。 本专利技术从台湾家白蚁的cDNA中克隆得到C型葡萄糖苷酶(命名：CfBG GlulC)，根据蛋白质结构预测和同源性序列分析，找出了一系列突变位点，在这些氨基酸位 点上进行点突变，得到了一系列突变体酶。经过蛋白质表达与验证，发现有几个突变体酶的 催化活性显著增强。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过基因工程的手段对白蚁C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC) 进行定点突变改造，得到酶活性显著提高的C型3 -葡萄糖苷酶突变体，使该酶能更好的应 用到工业生产和实际应用中。 本专利技术提供的一系列定点突变改造的C型0 _葡萄糖苷酶突变体，是由来源于白 蚁的C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)进行定点突变产生的。 原亲本C型0 -葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示，其 特征在于原亲本氨基酸序列的第170位的赖氨酸K分别变为丝氨酸S和色氨酸W，第182位 的苯丙氨酸F变为甲硫氨酸M，第252位的氨基酸组氨酸H变为天冬酰胺N。 将定点突变改造获得的C型葡萄糖苷酶突变体质粒转入大肠杆菌DH5a (Novagen公司）中，筛选阳性克隆，提取质粒测序后与模板序列SEQIDNO. 1比对，确认得 到四个酶活显著提高的突变体。 突变体的表示方法为：GlulC-原始氨基酸-位置-突变后氨基酸，所述突变体为： GlulC-K170S、GlulC-K170W、GlulC-F182M、GlulC-H252N。 本专利技术的另一目的是提供一种包含有c型0 -葡萄糖苷酶突变体DNA序列的突变 质粒； 本专利技术的另一目的是提供一种含有上述突变质粒的重组突变菌株。 所述突变体构建的具体步骤如下： (1)突变表达载体的构建： 本专利技术从实验室饲养的台湾家白蚁的唾液腺和肠道组织中，提取出RNA，经过反转录， 得到cDNA。 在NCBI基因数据库查到台湾家白蚁的葡萄糖苷酶基因（GenBank登录号为 奶，根据序列同源性，设计扩增引物，以得到的台湾家白蚁cDNA为模板进行PCR扩 增，将扩增产物插入到载体pET_28a(Novagen公司）上的多克隆位点沒aMlI和通oI之 间，转入feWi.DH5a(Novagen公司）感受态细胞中，筛选转化子，测序后与已有的序列 奶比对，不完全相同，本实验室得到的重组质粒称为pET-28a-GlulC。 将所得重组质粒转化入及?o/i.BL21 (DE3) (Novagen公司）进行表达，得到C型 3 -葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)，作为活性测定的对照。 我们在此酶的基础上，对其基因进行突变改造，以pET-28a-GlulC为模板，设计含 有突变位点的核苷酸序列引物，扩增通过PCR扩增得到突变质粒全长序列，将其利用Dpn I消化DNA模板后，进行1%琼脂糖凝胶电泳，割胶回收目的片段，经T4DNA连接酶处理后，将 连接产物直接转化到及'Oh'.DH5a(Novagen公司）的感受态细胞中，筛选转化子，提取质粒 测序，看相应位点上的氨基酸是否突变成功。突变成功的重组质粒称为pET-28a-GlulC-X (X为原始氨基酸-位置-突变后氨基酸)分别转化BL21 (DE3) (Novagen公司）进行 表达，即得到对应的突变体表达菌株。 (2)重组突变体表达菌株诱导表达产生突变体酶 将突变体表达菌株活化后，以1%的接种量转接入200mL的LB培养基(含50 y g/mL的卡 那霉素）中振荡培养，待〇D_约为0.4时加入0. 2mM的诱导剂IPTG，25°C振荡培养6h。收 集菌液，10000g离心收集菌体，加入20mLTris-HCl缓冲液超声破碎，离心取上清得到突变 体酶，分别测定酶活性。 本专利技术的优点： 通过定点突变技术，对台湾家白蚁C型葡萄糖苷酶（CfBGGlulC)第170位的赖氨 酸K、第182位的苯丙氨酸F和第252位的组氨酸H进行改造，构建了C型葡萄糖苷酶突 变体，显著提高了C型葡萄糖苷酶的酶活，本专利技术得到的突变体分别为GlulC-K170S、 GlulC-K170W、GlulC-F182M、GlulCH252N，这四株突变体的酶活都有了不同程度的提高， 分别为5. 2倍、2. 05倍、2. 9倍、2. 1倍。这对现今降解生物质尤其是纤维素类具有重大的意 义，可以使自然界中的秸杆等在葡萄糖苷酶的促进催化作用下，更好更快速的降解产 生葡萄糖，实现催化过程的高效优化。产生的葡萄糖又可以进一步参与更多的工业过程，如 生物燃料乙醇的生产，生物洗涤剂等一系列相关工艺。通过改造3 -葡萄糖苷酶使其活性 增强，更能满足社会生产的要求，有广阔的应用前景。【附图说明】 图1为本专利技术中所得的突变体的突变位点处核苷酸示意图，箭头指向位点为突变 位点； 图2为本专利技术构建的突变株以及原始菌株中C型0-葡萄糖苷酶的表达情况； 图3为本专利技术构建的突变株以及原始菌株表达酶的酶活性情况。【具体实施方式】 下面通过具体实施例对本专利技术作进一步的说明。 实施例1:突变表达质粒的构建及重组大肠杆菌的获得 1.突变表达质粒的构建 根据蛋白质结构预测和同源性序列分析，找出了一系列突变位点，在这些氨基酸位点 上进行点突变，得到了一系列突变体酶。经过蛋白质表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组质粒，称为pET‑28a‑Glu1C，其特征在于，所述重组质粒源于pET‑28a，并包含有白蚁的β‑葡萄糖苷酶基因DNA序列，其中所述的白蚁的β‑葡萄糖苷酶基因DNA序列的GenBank 登录号为JN565079。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王继峰，吴黎明，冯婷婷，刘海涛，周阳，施海峰，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。