本发明专利技术提供一种琼胶酶及其制备方法，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，所述琼胶酶的核苷酸序列的如SEQ NO.1所示；琼胶酶的氨基酸序列如SEQ NO.2所示；核苷酸分子的载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒；核苷酸分子的细胞由所述载体转化而得；所述琼胶酶的核苷酸分子的细胞是包含所述核苷酸分子或用所述载体转化的大肠杆菌或包含所述核酸分子或用所述载体转化的毕氏酵母。本发明专利技术制备出能够高效表达并分泌琼胶酶的重组生产株，实现琼胶酶的生产产业化，对琼胶和龙须菜有良好的水解能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，更具体涉及一种琼胶酶、其编码序列、含有该序列的重组质粒和菌株，以及由所述序列编码的琼胶酶在大肠杆菌中的表达和在酵母细胞中的发酵生产。技术背景琼胶酶是一类来自海洋微生物细胞和海洋动物体内的一种水解酶，可以水解琼脂产生琼胶寡糖。近几年，随着糖生物学的高度发展和深入研究，越来越多的海藻多糖及其水解产物得到了许多学者高度的关注，其中对于琼胶寡糖的研究就是其中的重要的一例。琼胶寡糖有多种重要的生物活性，加之其在保健食品工业上的应用与发展，有关琼胶寡糖的研究及应用成为了结构化学、分子生物学、医学和食品学等研究领域的热点之一。对琼胶酶的研究较早的是在1957年，Yaphe用来白大西洋假单胞菌属的琼胶酶进行了对美国Difco琼脂、新西兰Davis琼脂和石花菜属、江篱属、鸡毛菜属以及龙须菜等的水解研究，表明了该琼胶酶对这些底物均有水解作用。同时进行了对含有多糖结构的角叉菜胶的水解研究，该琼胶酶对其没有水解作用。该琼胶酶水解底物产生的低聚糖都以新琼二糖作为基本结构单元。1968年，Duckworth等从一株噬细胞菌属细菌培养液中分离纯化得到胞外琼胶酶。该琼胶酶作用于紫菜胶的最佳pH条件为7.2，温度为40~41°C。其作用方式为内切，可以在低浓度下快速降低琼胶和紫菜胶的粘度。对很多多糖的水解作用表明该琼胶酶对琼脂结构的糖类具有高度的专一性。1969年，Duckworth等对同样从噬细胞菌属细菌培养液中分离纯化得到琼胶酶进行研究，表明了该琼胶酶对于新琼二糖、新琼四糖或其含有6-0-甲基-D-半乳糖还原端的类似物没有活性。对新琼八糖的作用方式表明其为切断中心的D-半乳糖苷键生成两分子的四糖，但是对于八聚糖和六聚糖的外部的D-半乳糖苷键的水解作用很弱。该琼胶酶对硫酸盐化的低聚糖的水解表明在低聚糖中必须要有新琼四糖还原端。1990年，Aoki等采用硫酸钱沉淀、连续的柱色谱法从一株弧菌属种分离纯化出一种声琼胶酶。该琼胶酶的相对分子量20 kDa，最适作用pH值为5.5，在pH 4.0-9.0范围内和温度为45°C以下都很稳定。该琼胶酶是一种内切酶，并且对新琼四糖、聚合度较大的寡聚糖和琼胶都具有水解作用，但是对卡拉胶没有水解作用。1992年，Leon等从一株交替单胞菌属菌株中分离纯化出一种胞外的琼胶酶，研究了该琼胶酶的一些酶学性质。其相对分子质量为52 kDa，对一些盐敏感，最佳作用pH值约为6.5。1993年，potin等对单胞菌属的菌株GJ1B产生的琼胶酶进行了分离纯化，该琼胶酶系α -琼胶酶。他们对1978年发现的末鉴定的菌株GJ1B进行了研究，利用13C_NMR研究了该菌株水解琼脂的产物，并且将该菌株归类为单胞菌属。2002年，Suzuki等从杆菌MK03中分离纯化得到一种能够水解低聚合度的α -琼胶寡糖的水解酶。采用硫酸铵沉淀、阴离子交换层析以及凝胶柱层析的方法对酶进行了分离纯化，SDS-PAGE和凝胶柱分别表明该酶的相对分子量为320kDa和42 kDa,说明了其为八聚糖。该水解酶能够水解新琼二糖的a-1，3糖苷键，其N-末端的氨基酸序列和当时己知的水解琼胶寡糖的酶和琼胶酶都没有相似性，因此是个新型的α -琼胶寡糖水解酶。Ohta等在2005年从一株嗜盐菌JAMB-A3 3中分离得到一种α -琼胶酶，该菌株分离自日本海域的污泥中。分离得到的a-琼胶酶相对分子质量为85 kDa该琼胶酶水解琼脂的作用方式为外切型的，主要的产物为新琼四糖，同时还可以水解新琼六糖以及紫菜胶。2008年，Fu等从嵘螺的内脏中分离到的海洋细菌Jigetrivorems albus0 Lee等2000年研究了从海洋中分离得到的假单胞菌W7产生的β -琼胶酶的基因序列，此琼胶酶由1926by的开放阅读框，由642个氨基酸组成，其相对分子质量为69，540Da。其中259个氨基酸的缺失会导致编码的蛋自完全失去水解琼脂的活性，说明了这259个氨基酸是编码该琼胶酶必不可少的氨基酸，有着重要的作用。其后，随着生物工程技术的高度发展和对琼胶酶研究的日益深入，许多学者都进行了琼胶酶的基因克隆研究，使琼胶酶的产量和酶活都很大程度地提高了对科学研究和工业应用都作出了重要的贡献。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种琼胶酶及基因和制备方法，以及将其在大肠杆菌和酵母细胞中克隆表达的方法，解决上述现有技术的不足之处，制备出能够高效表达并分泌琼胶酶的重组生产株，实现琼胶酶的生产产业化。一种琼胶酶，所述琼胶酶氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一种琼胶酶基因，编码权利要求1所述琼胶酶；所述基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。包含所述琼胶酶基因的重组载体，所述载体是大肠杆菌质粒或酵母质粒。所述的载体为 pPIC9k_Agarase。包含所述的琼胶酶基因的细胞，所述细胞选大肠杆菌细胞或酵母细胞；所述细胞由权利要求3所述重组载体转化而得。所述细胞是包含所述琼胶酶核苷酸序列或用所述重组载体转化的大肠杆菌细胞或毕赤酵母细胞。琼胶酶基因的制备方法，所述琼胶酶的制备步骤包括:琼胶酶基因的获得:从海泥中筛选得到一株能在琼胶平板上产生透明圈的微生物，通过16srDNA分析鉴定为耐热微球菌Microbulbifer iAe'Tfflo1Jerafts.;利用琼胶酶氨基酸保守片段的简并引物，获得其一段琼胶酶的编码基因；再通过genome walking获得其全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到琼胶酶基因。所述的琼胶酶基因的重组载体的制备方法，所述琼胶酶基因的重组载体的制备为:采用权利要求2所述琼胶酶基因编码序列经AcoRI和Abi I双酶切后与说oRI和Not\双酶切的pPIC9k载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-Agarase。琼胶酶基因的细胞的构建方法，所述细胞是用所述重组载体转化来构建的；所述细胞选大肠杆菌细胞和酵母细胞，选用大肠杆菌和毕赤酵母构建表达琼胶的重组细胞。所述的琼胶酶的制备方法，培养所述包含琼胶酶基因、的细胞或包含琼胶酶基因的重组载体转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物:通过包含本专利技术琼胶酶基因的酵母发酵来生产琼胶酶，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。详述 本专利技术涉及从海洋环境中筛选琼胶酶产生菌及克隆琼胶酶基因。实施方式之一，本专利技术提取经 16s rDNA 鉴定为 microbulbifer iAeiTW?基因组 DNA，利用 Agarase 氨基酸保守片段的简并引物，获取一段Agarase的编码基因；再通过genome walking技术获得全长，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到Agarase基因。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQ ID N0.1所示的核酸序列，称之为Agarase。实施方式之一中，所述编码序列是SEQ ID N0.1中的核苷酸1至1311所示的核苷酸序列。本专利技术还涉及包含所述Agarase编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本专利技术Agarase编码序列经方coRI和Not\双酶切后与说oRI和Not\本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种琼胶酶，其特征在于：所述琼胶酶氨基酸序列如 SEQ ID NO.2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李仁宽，叶秀云，陈增，
申请(专利权)人：福建福大百特科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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