本发明专利技术涉及一种整合型麦芽糖假丝酵母基因表达系统及其应用。所述系统包括组氨酸营养缺陷型的麦芽糖假丝酵母以及表达构建体，所述表达构建体包括元件：Origin，GAL1启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子和麦芽糖假丝酵母His5基因。经验证该表达系统可用于多种蛋白的表达，表达效率和表达量良好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
；更具体地，本专利技术涉及一种新的整合型麦芽糖假丝酵母基因表达系统的构建，及其在蛋白质生产中的应用。
技术介绍
自40多年前(1964年)Komagata等首次描述无芽孢酵母——麦芽糖假丝酵母 (Candida maltosa)，就引起了广泛的学术和工业兴趣。麦芽糖假丝酵母能够在以正构烷烃或脂肪酸作为唯一碳源作和能量的条件下生长。第一个麦芽糖假丝酵母分离株是从谷氨酸单钠制造过程中的中和槽的胶黏剂中获得。在19世纪60年代初期，碳氢生物化学成为工业研究的主题，大多数石油公司致力于微生物的潜在应用，用于生产作为食品(动物饲料) 的单细胞蛋白质和用于氨基酸、脂肪酸、留醇和其它有商业价值的物质的生物化学合成。通过基因工程技术对麦芽糖假丝酵母中宿主_载体系统的改进，带来一个显著的进步，使其更广泛的应用于生物技术和生物工业，也将增加该酵母用于基础研究的功用。与此同时，基于麦芽糖假丝酵母的特性，其可能被用于异源蛋白质的功能性表达，特别是用于疏水性蛋白质的生产。另一方面，其可用于有机化学生产中的生物转化反应。基于麦芽糖假丝酵母中宿主-载体系统改进中的最新进展，从已构建，并进行异源和同源蛋白质表达测试的麦芽糖假丝酵母中分离得到数个强表达启动子。在低拷贝复制表达质粒中使用麦芽糖假丝酵母的PGKl (磷酸甘油酸激酶)基因的启动子和终止子区域， 证实了内生P450基因和编码乳酸克鲁维酵母β -半乳糖苷酶的异源基因的功能性表达。 ALKUALK4和Ρ450启动子被用作麦芽糖假丝酵母细胞中的一些报告基因。强调控的，半乳糖-诱导和葡萄抑制的GALl (半乳糖激酶)启动子，在高拷贝(>20)质粒中被用于Ρ450 基因的高表达，ALKl-A也得到了同样的应用。另外，编码过氧化物酶体乙酰辅酶A氧化酶蛋白质ΡΧΡ-2和ΡΧΡ-4的基因Ρ0Χ2和 Ρ0Χ4分别在麦芽糖假丝酵母中得到了表达。也有报道说，使用表达质粒，实现了大肠杆菌功能性内酰胺酶在麦芽糖假丝酵母中的表达。然而，本领域至今还没有关于异源蛋白质在整合型麦芽糖假丝酵母中的表达的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种整合型麦芽糖假丝酵母基因表达系统及其应用。在本专利技术的第一方面，提供一种蛋白表达(或生产)系统，其包括(1)麦芽糖假丝酵母，其是组氨酸营养缺陷型的酵母；(2)表达构建体，所述表达构建体从5’ 一 3’依次包括以下可操作性相连的元件GALl启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因， Origin。在另一优选例中，所述的Origin是ApR-Origin。在另一优选例中，所述的终止子是C-PGK1。在另一优选例中，所述的α-结合因子分泌引导序列和终止子之间，包括至少一个多克隆位点(酶切位点)，用于外源蛋白的编码基因的插入。在另一优选例中，GALl启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因各个元件之间，包括或不包括间隔序列，该间隔序列的长度为I-IOObp ；较佳地 l-50bp。在另一优选例中，GALl启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因，Origin各个元件之间，包括或不包括多克隆位点(酶切位点)的DNA序列。在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码基因包括(但不限于)植酸酶基因，淀粉酶基因。在另一优选例中，所述的植酸酶基因是Non-K12大肠杆菌(Escherichia coli)植酸酶基因。在另一优选例中，所述的淀粉酶基因是环状芽孢杆菌(Bacillus circulars)淀粉酶基因。在另一优选例中，所述的Origin的DNA序列如SEQ ID NO 5所示；或所述的GALl启动子的DNA序列如SEQ ID NO 2所示；或所述的α -结合因子分泌引导序列如SEQ ID NO 3所示；或所述的终止子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；或所述的麦芽糖假丝酵母His5基因的DNA序列如SEQ ID NO=I所示；或所述的植酸酶基因的DNA序列SEQ ID NO 8所示；或所述的淀粉酶基因的DNA序列SEQ ID NO 9所示。在另一优选例中，所述的表达构建体是表达载体。在另一优选例中，所述的表达构建物的DNA序列如SEQ ID NO 7所示。在另一优选例中，所述的麦芽糖假丝酵母在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是CGMCC No. 4499。在本专利技术的另一方面，提供所述的蛋白表达系统的用途，用于表达外源蛋白。在另一优选例中，所述的外源蛋白包括(但不限于)植酸酶基因，淀粉酶基因。在本专利技术的另一方面，提供一种表达外源蛋白的方法，其包括(a)提供所述的蛋白表达系统；(b)将外源蛋白的编码基因的DNA序列插入到所述表达构建体的α-结合因子分泌引导序列和终止子之间，获得携带外源蛋白的编码基因的表达构建体；(c)将所述的携带外源蛋白的编码基因的表达构建体转入到所述麦芽糖假丝酵母中，从而获得基因组中整合有该表达构建体的麦芽糖假丝酵母；(d)培养所述的基因组中整合有该表达构建体的麦芽糖假丝酵母，从而表达所述的外源蛋白。在另一优选例中，所述方法还包括(e)从培养物中分离(或纯化)所述的外源蛋白。在本专利技术的另一方面，提供一种人工构建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 8 (植酸酶的DNA序列)所示。在本专利技术的另一方面，提供一种人工构建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 9 (淀粉酶的DNA序列)所示。在另一优选例中，所述的核酸分子在麦芽糖假丝酵母基因表达系统中的表达出蛋白质。在另一优选例中，所述核酸分子是经过密码子优化的核酸分子。在本专利技术的另一方面，提供一种宿主细胞，其是组氨酸营养缺陷型的酵母；且其中还包含表达构建体，所述表达构建体从5’一 3’依次包括以下可操作性相连的元件GAL1 启动子，α -结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因，Origin。在另一优选例中，所述的表达构建体整合于所述宿主细胞的基因组中。在另一优选例中，所述的宿主细胞是(但不限于)来自中国普通微生物保藏中心 (CGMCC)的细胞株 CGMCC No. 2. 1371。在本专利技术的另一方面，提供一种组氨酸营养缺陷型的麦芽糖假丝酵母，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是CGMCC No. 4499。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、组氨酸营养缺陷型麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的突变株在各培养基平板上的生长状态。图2、麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371及其营养缺陷型突变株的生长曲线。图3、麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的GALl启动子基因序列(SEQID NO 2)。图4、麦芽糖假丝酵母基因表达系统的α -结合因子分泌引导序列(SEQ IDNO 3)。图5、麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的C-PGK1转录终止子序列(SEQID NO 4)。图6、麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的His5基因序列(SEQ ID NO :1)。图7、大肠杆菌中DNA扩增片段ApR本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种蛋白表达系统，其包括：（１）麦芽糖假丝酵母，其是组氨酸营养缺陷型的酵母；（２）表达构建体，所述表达构建体从５’→３’依次包括以下可操作性相连的元件：ＧＡＬ１启动子，α－结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母Ｈｉｓ５基因，Ｏｒｉｇｉｎ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶秀云，靳伟刚，陈萍，张洋，罗鋆琳，应喜娟，傅仙玉，
申请(专利权)人：福建福大百特科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：35
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