本发明专利技术涉及纺织品微生物鉴定领域，特别是一种快速鉴定纺织品中白假丝酵母菌的方法，针对现有纺织品中白假丝酵母菌鉴定过程中所存在的问题，其解决问题的技术方案是一种快速鉴定纺织品中白假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：步骤一：检样采集；步骤二：样液制备；步骤三：样液稀释，过滤；步骤四：白假丝酵母菌检测培养；步骤五：Biotyper系统标准品溶液和基质溶液的制备；步骤六：用甲酸提取法提取菌落蛋白；步骤七：MALDI BioTyper自动鉴定；步骤八：结果计算：本发明专利技术中纺织品中白假丝酵母菌鉴定方法考虑了各种样品面积的大小、及厚度，采集的样品更具代表性，使检测结果更准确，该方法高度自动化，减少实验误差，不需要其他附加实验，节约检测成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纺织品微生物检测领域，特别是一种快速检测纺织品中白假丝酵母菌 的方法。
技术介绍
传统白假丝酵母菌的检测通常为白假丝酵母菌培养，然后做芽管试验，糖发酵试 验等生化试验验证，主要包括以下步骤： 1、增菌培养：取供试液10mL直接或处理后接种至适量（不少于100mL)的沙氏葡 萄糖肉汤培养基中，培养48h~72h; 2、分离培养：取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养 24h~48h(必要时延长至72h)。 白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光 滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有皱摺。若平板上无菌 落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌；如平板上生 长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2个~3个菌落分别接种至念珠菌显色 培养基平板上，培养24h~48h(必要时延长至72h);若平板上无绿色或翠绿色的菌落生 长，判供试品未检出白色念珠菌；若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的 菌落接种于1 %吐温80玉米琼脂培养基上，培养24h~48h。取培养物进行染色，镜检及芽 管试验； 3、芽管试验：挑取1%吐温80玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清 的载玻片上，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35°C~37°C、lh~3h，置显微镜下观察，可见 到由孢子长出短小芽管，若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽 管，判供试品未检出白色念珠菌； 4、糖发酵实验：取18mm口径的试管，放入倒置的15mm口径的试管，棉塞封口后 灭菌待用，先把葡萄糖，蔗糖，麦芽糖配成糖发酵培养基，每取4mL装入小试管中并接入 菌体一环，摇匀后倒置于大试管中，棉塞封口后26°C培养，其间观察培养基颜色变化及是 否有气体产生； 5、碳源化合物的同化-液体实验：选用葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，可溶性淀粉，甘 油，柠檬酸；把活化的菌接种于4mL无菌氮源液体培养基中，26°C培养2d，以消耗多余的 碳源；在15mm口径无菌试管中每管加入4mL液体培养基；然后用无菌吸管把经过饥饿培养 的菌悬液，滴入准备好的试管内，每管五滴，棉塞封口后26°C静置培养2d，摇匀后观察结 果，浊度显增大者为阳性，反之则为阴性； 上述的传统方法检测白假丝酵母菌，培养时间长，敏感性低，步骤繁琐，容易导致 杂菌污染，影响最终结果的检测，且均为定性的报告结果，而白假丝酵母菌为条件致病菌， 广泛存在自然界中，对热的抵抗力不强，加热至60°c、lh后即可死亡，但对干燥、日光、紫外 线及化学制剂等抵抗力较强，当机体免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制约作用 失调，则本菌大量繁殖并改变生长形式（芽生菌丝相）侵入细胞引起疾病，其感染剂量较 高，一般大于1〇5个真菌，所以对白假丝酵母菌的定性检测对其致病性的指导作用非常小， 定量的检测则更具意义。 传统的纺织品的样品采集常用的有两种： 第一种涂抹法，这种方法最大优点是不破坏样品，适用于样品质地比较薄而密集， 细菌含量较高的样品，但在实际运用中，由于纺织品具有多孔结构和吸水特性，而且纺织品 有一定的厚度，仅用表面涂抹取样不能完全检测到样品受污染真正情况，当遇到细菌含量 较低的样品或质地较厚实的样品时，涂抹过程中会出现样品采集不彻底，样品不完全采集 的情况，易因检出率低，引起假阴性结果，从而误导检测人员产生错误判定； 第二种剪碎20g称量法，这种方法破坏了样品，适用于细菌含量低的小面积纺织 品，但实际中纺织品种类千差万别，面积大小、厚度不一，如果仅称量20g作为检样，不具代 表性，如果样品吸水性强，所制样品不均质，更易造成假阴性结果。
技术实现思路
针对现有纺织品中白假丝酵母菌检测过程中所存在的问题，本专利技术的目的在于提 供一种纺织品中白假丝酵母菌采集、检测新方法，克服现有纺织品中白假丝酵母菌检测的 过程中存在的不足与缺陷。 其解决问题的技术方案是： ，包括以下步骤： 步骤一：检样采集 在送检的纺织品四周和中间均匀布控5个~10个采样点，用灭菌不锈钢直尺测 量，每个采样点按5cmX5cm(25cm2)面积范围剪裁，每25cm2采样面积为1份检样，如果被检 样品面积过大或过小，采样面积可按比例扩大或缩小； 步骤二：样液制备 将采集好的5份~10份检样放入盛有200mL灭菌生理盐水的全滤网无菌均质袋 中，用拍击式均质器拍打lmin~2min，得到一个生理盐水样液，制成样液作为原液，如果被 检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，灭菌生理盐水量可按每次l〇〇mL递增，直至 能抽提有足够100mL~120mL的测试样液；每个样液30min内抽提检测完毕； 步骤三：样液稀释，过滤 将步骤二制备的样液稀释后用滤膜过滤备用，每张滤膜过滤100mL样液；应根据 样品污染情况确定样液的稀释倍数，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于100个菌落为宜， 如果样品污染严重，可将样液原液稀释10倍，取l〇〇mL稀释液过滤； 步骤四：白假丝酵母菌检测培养 用无齿灭菌镊子夹取孔径为0.45ym微孔灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上， 贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将过滤后的样液注入滤器中，打开滤器阀门，在负 0. 5X105Pa下抽滤，样液滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤 膜边缘部分，移放在孟加拉红培养基平板上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴 紧，两者间不留气泡，然后将孟加拉红平板放入28°C±1°C培养箱内培养24h~48h，白假丝 酵母菌在孟家拉红培养基养出的菌落具有以下特征：浅粉色大的形状不规则菌落，中心凹 陷，边缘色浅不整齐，菌落表面干燥，有的菌落有菌丝；酿酒酵母菌在孟家拉红培养基上培 养出的菌落具有以下特征：无菌丝，边缘整齐，浅粉色，中心凹陷的大菌落；每个平板上挑 取5个可疑菌落，用微生物快速检测系统（MALDIBioTyper)进行验证； 步骤五：微生物快速检测系统（MALDIBioTyper)标准品溶液和基质溶液的制备 使用微生物快速检测系统（MALDIBioTyper)专用的标准品BacterialTest Standard(BTS)加入标准溶剂50 %乙腈+47. 5 %水+2. 5 %三氟乙酸50y1，使用移液器 反复吹吸的方式，溶解BTS粉末（不能剧烈震荡溶解）；室温放置5分钟，之后重复吹吸， 13000rpm离心2min，分装，-20°C冰箱保存，禁止反复冻融溶解好的BTS，每次使用取一管； 使用微生物快速检测系统（MALDIBioTyper)专当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测纺织品中白假丝酵母菌的方法，包括以下步骤：步骤一：检样采集在送检的纺织品四周和中间均匀布控5个～10个采样点，用灭菌不锈钢直尺测量，根据纺织品面积大小，每件纺织品共采集5份～10份检样；采样面积可按送检的纺织品面积大小扩大或缩小；步骤二：样液制备将采集好的5份～10份检样放入盛有200mL灭菌生理盐水的全滤网无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，得到一个生理盐水样液，制成样液作为原液，如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，灭菌生理盐水量可按每次100mL递增，直至能抽提有足够100mL～120mL的测试样液；每个样液30min内抽提检测完毕；步骤三：样液稀释，过滤将步骤二制备的样液稀释后用滤膜过滤备用，每张滤膜过滤100mL样液，应根据样品污染情况确定样液的稀释倍数，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于100个菌落为宜，如果样品污染严重，可将样液原液按10倍递增稀释，取100mL稀释液过滤；步骤四：白假丝酵母菌检测培养用无齿灭菌镊子夹取孔径为0.45μm微孔灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将过滤后的样液注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5×105Pa下抽滤，样液滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在孟加拉红培养基平板上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者间不留气泡，然后将孟加拉红平板放入28℃±1℃培养箱内培养24h～48h，白假丝酵母菌在孟家拉红培养基养出的菌落具有以下特征，浅粉色大的形状不规则菌落，中心凹陷，边缘色浅不整齐，表面干燥，有的菌落有明显菌丝，酿酒酵母菌在孟家拉红培养基培养出的菌落具有以下特征：无菌丝，边缘整齐，浅粉色，中心凹陷的大菌落；每个平板上挑取5个可疑菌落，用微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)进行验证；步骤五：微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)专用的标准品溶液和基质溶液的制备使用微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)专用的标准品Bacterial Test Standard(BTS)加入标准溶剂50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸50μl，使用移液器反复吹吸的方式，溶解BTS粉末(不能剧烈震荡溶解)；室温放置5min，之后重复吹吸，13000rpm离心2min，分装，‑20℃冰箱保存，禁止反复冻融溶解好的BTS，每次使用取一管；使用微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)专用的基质HCCAportioned加入50％乙腈+47.5％水+2.5％三氟乙酸50μl)250μl标准溶剂(终浓度10mg/mL)，振荡混匀，直到形成澄清溶液；步骤六：用甲酸提取法提取菌落蛋白在EP管中加入300μl去离子水，取待测微生物样本至离心管中，使用移液枪吹吸或涡旋振荡充分混匀，加入900μl乙醇，充分混匀；13000rpm离心2min，倒去上清，再次离心，使用移液枪完全去除残余的上清液，整个过程不应触碰沉淀；室温下干燥沉淀2min～3min；加入70％甲酸水溶液1μl～80μl，根据生物样品量能充分混合为准，通过移液枪吹吸或者涡旋振荡充分混合，加入与甲酸等体积纯乙腈，充分混匀，13000rpm离心2min，吸取1μl上清，滴加到MALDI靶板上，并在室温下晾干，1h内，用1μl HCCA基质溶液覆盖上述样液点，并在室温下晾干；步骤七：微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)自动鉴定将靶板放入仪器，自动鉴定结果，与标准图谱对照确定白假丝酵母菌；步骤八：结果计算：然后由步骤七鉴定出的结果来直接计数孟加拉红培养基平板上对应为白假丝酵母菌特征菌落，以每平方厘米样液中的白假丝酵母菌个数报告结果,按式(1)计算，如果样品原液培养基上无菌落长出，结果报告为0CFU/cm2；如果10倍样品稀释液培养基上无菌落长出，结果报告为＜10 CFU/cm2；若检测为白假丝酵母菌，则选择培养基上菌落数小于100 CFU的平板计数，按式(1)计算报告。根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中白假丝酵母菌的方法，其特征在于步骤一中检样采集每个采样点按5cm×5cm面积范围剪裁，每25cm2采样面积为1份检样。根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中白假丝酵母菌的方法，其特征在于步骤七中微生物自动检测所用仪器为微生物快速检测系统(MALDI BioTyper)。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李轲，郭会清，禹建鹰，王永杰，苗丽，白杰，杨娜，乔晴，王新辉，王珊，
申请(专利权)人：郭会清，
类型：发明
国别省市：河南;41
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