一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法技术

本发明专利技术涉及纺织品微生物检测领域，特别是一种快速检测纺织品中大肠菌群的法包括以下步骤：步骤一：检样采集；步骤二：样液制备；步骤三：样液稀释，过滤；步骤四：菌群培养检测；步骤五：结果计算；步骤六：结果报告，本发明专利技术采用生理盐水洗脱纺织品中的微生物，采用孔径为0.45μm微孔薄膜快速抽提，此种滤膜能滤过大量液体，并将样液中所含的细菌截留在滤膜上，然后将滤膜贴在相应微生物测试片上，经过培养后，大肠菌群在测试片上长出具有相应特征性的菌落，直接计数菌落数，计算出每平方厘米中样品所含大肠菌群数，本发明专利技术检测法考虑了各种样品面积的大小、及厚度，采集的样品更具代表性，使检测结果更准确，对样品的真实情况反映更确切。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及纺织品微生物检测领域，特别是一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法。
技术介绍
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，大肠菌群在环境中广泛存在，该菌主要来自人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价产品的卫生质量,推断产品中受肠道致病菌污染的程度，大肠菌群超标也意味着致病菌超标的机会增大，危害人体健康的几率也增加。传统的纺织品中样品采集，大肠菌群的检测方法主要有：传统方法1(SN/T 3335-2012《进出口纺织品微生物项目检验规范》)，打开3个以上包装，共称取20g剪碎，制成1:10样液乳糖胆盐发酵，将待检样品接种于乳糖,胆盐发酵管内,置36℃±1℃温箱内,培养24h±2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠菌群阴性,如有产气者,则进行分离培养,将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上,置36℃±1℃温箱内,培养8h～24h,然后取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验；在上述平板上,挑取可疑大肠菌群菌落1个～2个进行革兰氏染色,同时接种乳糖发酵管,置36℃±1℃温箱内培养24h±2h,观察产气情况，凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌,即可报告为大肠菌群阳性。传统方法2(GB/T18204.4-2013《公共场所卫生检验方法第4部分：公共用品用具微生物》)选取5cm×5cm的面积范围，用灭菌湿润棉拭子涂抹5次，制成1:10样液多管发酵法，用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液，另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管,根据检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管,多管发酵法包括初(步)发酵试验、板分离和复发酵试验三个部分:1、初(步)发酵试验发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一德汉氏小套管因为大肠菌群能发酵乳糖而产酸产气，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂，细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h内小套管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色改变，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果，但也有个别其他类型的细菌在此条件下也可能产气；此外产酸不产气的也不能完全说明是阴性结果。在量少的情况下，也可能延迟到48h后才产气，此时应视为可疑结果，因此，以上两种结果均需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。48h后仍不产气的为阴性结果。2、平板分离平板培养基一般使用复红亚硫酸钠琼脂(远藤氏培养基，Endo＇s medium)或(伊红美蓝琼脂eosin methylene blueagar，EMB agar)，前者含有碱性复红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛即和复红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂平板含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色(龙胆紫的紫色)菌落。初发酵管24h内产酸产气和48h产酸产气的均需在以上平板上划线分离菌落。3、复发酵试验以上大肠菌群阳性菌落，经涂片染色为革兰氏阴性无芽胞杆菌者，通过此试验再进一步证实。原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。传统方法对大肠菌群的测定达到只限在水，及食品检测领域，在纺织品中由于纺织品采样及细菌的含量低等问题导致应用受到限制。纺织品的样品采集常用的方法：第一种是涂抹法，这种方法最大优点是不破坏样品，适用于样品质地比较薄而密集，细菌含量较高的样品，但在实际运用中，由于纺织品具有多孔结构和吸水特性，而且纺织品有一定的厚度，仅用表面涂抹取样不能完全检测到样品受污染真正情况，当遇到细菌含量较低的样品或质地较厚实的样品时，涂抹过程中会出现样品采集不彻底，样品不完全采集的情况，易因检出率低，引起假阴性结果，从而误导检测人员产生错误判定。第二种是剪碎20g称量法，这种方法破坏了样品，适用于细菌含量低的小面积纺织品，但实际中纺织品种类千差万别，面积大小、厚度不一，如果仅称量20g作为检样，不具代表性，如果样品吸水性强，所制样品不均质，更易造成假阴性结果。传统的检测方法，不仅耗费时间较长而且多为定性检测，而现实中定量检测更具意义。
技术实现思路
针对现有纺织品中样品采集，大肠菌群的检测过程中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种纺织品中大肠菌群检测新方法，克服现有纺织品中样品采集，大肠菌群检测的过程中存在的不足与缺陷，其解决问题的技术方案是：一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法，包括以下步骤：步骤一：检样采集在送检的纺织品四周和中间均匀布控5个～10个采样点，用灭菌不锈钢直尺测量，每个采样点按5cm×5cm(25cm2)面积范围剪裁，每25cm2采样面积为1份检样，根据纺织品面积大小，每件纺织品共采集5份～10份检样；如果被检样品面积过大或过小，采样面积可按比例扩大或缩小；步骤二：样液制备将采集好的5份～10份检样放入盛有200mL灭菌生理盐水的全滤网无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，得到一个生理盐水样液，制成样液作为原液，如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，灭菌生理盐水量可按每次100mL递增，直至能抽提有足够100mL～120mL的测试样液；每个样液30min内抽提检测完毕；步骤三：样液稀释，过滤应根据样品污染情况确定样液的稀释倍数，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于100个菌落为宜，每张滤膜过滤100mL样液；如果样品污染严重，可将样液原液稀释10倍，取100mL稀释液过滤；步骤四：菌群培养检测取出大肠菌群测试片，在室温下放置10min，揭开覆盖薄膜，吸取1mL无菌水或生理盐水于测试片培养基上，盖上覆盖薄膜，常温放置1h，使测试片培养基完全水化，用无齿灭菌镊子夹取孔径为0.45μm微孔灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将制好的样液注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5×105Pa下抽滤，样液滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法，其特征在于包括以下步骤：步骤一：检样采集在送检的纺织品四周和中间均匀布控5个～10个采样点，用灭菌不锈钢直尺测量，根据纺织品面积大小，每件纺织品共采集5份～10份检样；采样面积可按送检的纺织品面积大小扩大或缩小；步骤二：样液制备将采集好的5份～10份检样放入盛有200mL灭菌生理盐水的全滤网无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，得到一个生理盐水样液，制成样液作为原液，如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，灭菌生理盐水量可按每次100mL递增，直至能抽提有足够100mL～120mL的测试样液；每个样品30min内抽提检测完毕；步骤三：样液稀释，过滤应根据样品污染情况确定样液的稀释倍数，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于100个菌落为宜，每张滤膜过滤100mL样品；如果样品污染严重，可将样液原液稀释10倍，取100mL稀释液过滤；步骤四：菌群培养检测取出大肠菌群测试片，在室温下放置10min，揭开覆盖薄膜，吸取1mL无菌水或生理盐水于测试片培养基上，盖上覆盖薄膜，常温放置1h，使测试片培养基完全水化，用无齿灭菌镊子夹取孔径为0.45μm微孔灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将制好的样液注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5大气压下抽滤，样液滤完后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用灭菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在大肠菌群测试片上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与测试片完全贴紧，两者间不留有气泡，然后将测试片放入36℃±1℃培养箱内培养24h±2h，大肠菌群在测试片上培养出的菌落具有以下特征：红色小菌落，周围有气泡；步骤五：结果计算直接计数微生物测试片上产气泡的菌落，以每平方厘米样品中的大肠菌群个数报告结果：按式(1)计算，步骤六：结果报告如果样品原液测试片上无菌落长出，结果报告为0 CFU/cm2；如果10倍样品稀释液测试片上无菌落长出，结果报告为＜10 CFU/cm2；其它选择测试片上菌落数小于100 CFU的测试片计数，按式(1)计算报告。...

【技术特征摘要】
1.一种快速检测纺织品中大肠菌群的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一：检样采集
在送检的纺织品四周和中间均匀布控5个～10个采样点，用灭菌不锈钢直尺测量，根据纺织品面积大小，每件纺织品共采集5份～10份检样；采样面积可按送检的纺织品面积大小扩大或缩小；
步骤二：样液制备
将采集好的5份～10份检样放入盛有200mL灭菌生理盐水的全滤网无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，得到一个生理盐水样液，制成样液作为原液，如果被检样品大量吸水而导致不能吸出足够样液时，灭菌生理盐水量可按每次100mL递增，直至能抽提有足够100mL～120mL的测试样液；每个样品30min内抽提检测完毕；
步骤三：样液稀释，过滤
应根据样品污染情况确定样液的稀释倍数，以滤过一张无菌滤膜后能产生小于100个菌落为宜，每张滤膜过滤100mL样品；如果样品污染严重，可将样液原液稀释10倍，取100mL稀释液过滤；
步骤四：菌群培养检测
取出大肠菌群测试片，在室温下放置10min，揭开覆盖薄膜，吸取1mL无菌水或生理盐水于测试片培养基上，盖上覆盖薄膜，常温放置1h，使测试片培养基完全水化，用无齿灭菌镊子夹取孔径为0.45μm微孔灭...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭会清，李轲，苗丽，杨娜，乔晴，禹建鹰，王永杰，白杰，王新辉，王珊，
申请(专利权)人：郭会清，
类型：发明
国别省市：河南;41