一种用于检测大肠菌群的试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测大肠菌群的试剂盒及应用。该试剂盒包括引物序列和探针序列；其中：引物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物R1264组成；探针序列为探针Pb1156A。该试剂盒具有良好的灵敏度、特异性，可替代传统方法。该试剂盒能快速有效的对食品或其他样品中的大肠菌群进行计数，将大大降低现用的大肠菌群检测方法的人力和物力消耗，简化日常生产生活中大批量的食品或其他样品的抽检，因此，特别适合在食品领域中进行广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物检测领域，特别涉及一种用于检测大肠菌群的试剂盒及应用。
技术介绍
食物的微生物污染是影响食品安全的重要因素之一，在其贮藏与加工过程中，快速、准确地检测食物微生物污染，是控制和保障食品安全的重要手段。目前，对于食品中大肠菌群的检测，国内多数采用的检测方法是依据中华人民共和国国家标准《食品卫生微生物学检验-大肠菌群的快速检测》(GB/T4789.32-2002)。国标法检测结果的准确性、灵敏性均较高，但是操作繁杂、耗时较长，不适合于保质期短的食品检测；尽管快速检测国标法大大缩短了试验周期，操作也相对较易，但仍然需要使用大量玻璃容器和仪器，不便于现场操作。进出口行业标准《食品中大肠菌群和大肠杆菌快速计数法PetrifilmTM测试片法》(SN/T 1896-2007)中的3M试纸快速检测方法由于前处理简单，处理时间短，在生产加工企业的现场检测中具有较大优势，但是其检测效果和检测限量是否达到国家规定的食品卫生标准还有待证实，且造价成本较高，不适应于日常生产生活中大批量的食品抽检。由于大肠菌群的广泛存在，使得传统检测方法变得繁复且低效，不适应于现代食品检测中快速灵敏的要求。因此研究出一种能够同时检测食品中各种大肠菌群且快速简洁的通用型检测方法迫在眉睫。目前国内外应用于检测大肠菌群的分子生物学技术，主要分为三类：普通PCR技术、荧光PCR技术和基因芯片技术。基因芯片方法检测效率高，但技术还不成熟，假阳性率和假阴<br>性率都很难控制，而且成本较高，目前还处于研究阶段。普通PCR方法技术成熟，但是，由于检测样品中，微生物种类很多，引物设计是难点，引物特异性不高，容易造成假阳性结果；而且只能定性检测出大肠菌群，而不能定量；再者需要对PCR产物进行后处理，极易导致PCR产物污染。荧光PCR是在普通PCR的基础上，在扩增反应体系中加入一对特异性引物的同时再加入一个特异性的荧光探针，使用实时监测的荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，其除了具有普通PCR的优点外，还具有以下优点：(1)特异性更强，灵敏度更高：由于多使用了一条可与模板互补配对的荧光探针，从而提高了特异性，并且由自动化仪器收集荧光信号，避免了人工判断的主观性，又可进一步提高灵敏度；(2)全封闭反应，在线式实时监测荧光，无须PCR的对数期，摈弃普通PCR方法的受多因素干扰的终点分析法，使得定量更准确可靠；(3)可实现单管双检或多检，还可设计针对性内标，监控抽提效率及排除抑制剂干扰；(4)不接触有毒试剂，操作安全；(5)有利于规模化、自动化及联网管理；(6)适用范围更广，理论上可检测任何大肠菌群的核酸。但是，荧光定量PCR对引物的要求相对于普通PCR而言，更为苛刻。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种用于检测大肠菌群的试剂盒。该试剂盒能定量检测大肠菌群。本专利技术的另一目的在于提供所述试剂盒的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种用于检测大肠菌群的试剂盒，包括引物序列和探针序列；其中：引物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物R1264组成；探针序列为探针Pb1156A；所述的上游引物F1130a的序列为如下所述的任一条序列：核心序列A；或以核心序列A为中心，向5’和3’端分别或同时延伸1～10个核苷酸得到的序列；优选为核心序列A、向核心序列A的5’端延伸10个核苷酸得到的序列或向核心序列A的3’端延伸10个核苷酸得到的序列；核心序列A：5’-TCCTGCTGATGAAGCAGAACAA-3’；所述的上游引物F1130b的序列为如下所述的任一条序列：核心序列B；或以核心序列B为中心，向5’和3’端分别或同时延伸1～10个核苷酸得到的序列；优选为核心序列B、向核心序列B的5’端延伸10个核苷酸得到的序列或向核心序列B的3’端延伸10个核苷酸得到的序列；核心序列B：5’-ATATCGAACTCATGAAGCAGCATAA-3’；所述的下游引物R1264的序列为如下所述的任一条序列：核心序列C；或以核心序列C为中心，分别或同时向5’端延伸1～10个核苷酸以及向3’端延伸1～2个核苷酸得到的序列；优选为核心序列C、向核心序列C的5’端延伸10个核苷酸得到的序列或向核心序列C的3’端延伸2个核苷酸得到的序列；核心序列C：5’-CCATGCCGTGGGTTTCAATAT-3’；所述的探针Pb1156A的序列为如下所示的核心序列D；或以核心序列D为中心，分别或同时向5’端延伸1～2个核苷酸以及向3’端延伸1～10个核苷酸得到的序列；优选为核心序列D、向核心序列D的5’端延伸2个核苷酸得到的序列或向核心序列D的3’端延伸10个核苷酸得到的序列；核心序列D：5’-R-AACGCCGTGCGCTGYTCGCA-Q-3’，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团；上面所述的延伸均以大肠杆菌lacZ基因相应的序列为模板；所述的荧光报告基团优选为FAM(6-羧基荧光素)、HEX(六氯-6-甲基荧光素)或TET(四氯-6-羧基荧光素)；所述的荧光淬灭基团优选为TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)或BHQ1；所述的核心序列D为5'-HEX-AACGCCGTGCGCTGYTCGCA-BHQ1-3'；Y是简并碱基，为C或T；所述的用于检测大肠菌群的试剂盒，还包含用于荧光定量PCR的酶和试剂；所述试剂包括dNTP、缓冲液等；所述用于检测大肠菌群的试剂盒可定量检测大肠菌群，特别适合在食品领域中进行应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：(1)目前以分子方法检测大肠菌群的方法，其引物与探针设计主要集中在16S-23SrRNA，16S rRNA和lacZ(β-半乳糖苷酶基因)上，由于16S-23S rRNA，16S rRNA在大肠菌群的四个不同种属(大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、克雷伯氏菌和肠杆菌属)中拷贝数差异十分大，造成基于16S-23S rRNA和16S rRNA的检测大肠菌群的分子生物学方法，无法对大肠菌群总数进行直观的计数。本专利技术所提供的引物序列和探针序列是基于单拷贝的lacZ所设计的，从而能有效的避免前述缺陷。(2)本专利技术提供的引物和探针的检测灵敏度可达56个拷贝/mL，说明其具有良好的灵敏度。(3)本专利技术提供的引物和探针对于不含有大肠菌群的检测样本均无扩增信号，说明其具有良好的特异性。(4)由于本专利技术采用荧光PCR技术作为检测方法，整个反应均在封闭的反应管内进行，避免了其他核酸检测方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测大肠菌群的试剂盒，其特征在于：包括引物序列和探针序列；其中：引物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物R1264组成；探针序列为探针Pb1156A；所述的上游引物F1130a的序列为如下所述的任一条序列：核心序列A；或以核心序列A为中心，向5’和3’端分别或同时延伸1～10个核苷酸得到的序列；核心序列A：5’‑TCCTGCTGATGAAGCAGAACAA‑3’；所述的上游引物F1130b的序列为如下所述的任一条序列：核心序列B；或以核心序列B为中心，向5’和3’端分别或同时延伸1～10个核苷酸得到的序列；核心序列B：5’‑ATATCGAACTCATGAAGCAGCATAA‑3’；所述的下游引物R1264的序列为如下所述的任一条序列：核心序列C；或以核心序列C为中心，分别或同时向5’端延伸1～10个核苷酸以及向3’端延伸1～2个核苷酸得到的序列；核心序列C：5’‑CCATGCCGTGGGTTTCAATAT‑3’；所述的探针Pb1156A的序列为如下所示的核心序列D；或以核心序列D为中心，分别或同时向5’端延伸1～2个核苷酸以及向3’端延伸1～10个核苷酸得到的序列；核心序列D：5’‑R‑AACGCCGTGCGCTGYTCGCA‑Q‑3’，R为荧光报告基团，Q为荧光淬灭基团。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测大肠菌群的试剂盒，其特征在于：包括引物序列和探针序列；其中：引
物序列由上游引物F1130a、上游引物F1130b和下游引物R1264组成；探针序列为探针
Pb1156A；
所述的上游引物F1130a的序列为如下所述的任一条序列：核心序列A；或以核心序列A
为中心，向5’和3’端分别或同时延伸1～10个核苷酸得到的序列；
核心序列A：5’-TCCTGCTGATGAAGCAGAACAA-3’；
所述的上游引物F1130b的序列为如下所述的任一条序列：核心序列B；或以核心序列B
为中心，向5’和3’端分别或同时延伸1～10个核苷酸得到的序列；
核心序列B：5’-ATATCGAACTCATGAAGCAGCATAA-3’；
所述的下游引物R1264的序列为如下所述的任一条序列：核心序列C；或以核心序列C
为中心，分别或同时向5’端延伸1～10个核苷酸以及向3’端延伸1～2个核苷酸得到的序列；
核心序列C：5’-CCATGCCGTGGGTTTCAATAT-3’；
所述的探针Pb1156A的序列为如下所示的核心序列D；或以核心序列D为中心，分别或
同时向5’端延伸1～2个核苷酸以及向3’端延伸1～10个核苷酸得到的序列；
核心序列D：5’-R-AACGCCGTGCGCTGYTCGCA-Q-3’，R为荧光报告基团，Q为荧光
淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的用于检测大肠菌群的试剂盒，其特征在于：所述的上游引物
F1130a的序列为核心序列A、向核心序列A的5...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡双芳，肖性龙，李蓉，余以刚，吴晖，
申请(专利权)人：华南理工大学，中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44