一种免疫磁珠及其快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法技术

本发明专利技术公开了一种免疫磁珠及其快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法。免疫磁珠的制备为将奥奈达希瓦氏菌特异性抗体与活化的羧基化聚苯乙烯磁性微球进行孵育即可获得。快速检测方法为将免疫磁珠放入样品溶液中，使免疫磁珠上的抗体与奥奈达希瓦氏菌体抗原充分结合；去除样品基质得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体，洗涤干净，加显色液发生显色反应，再加入硫酸溶液终止显色反应，检测其OD450nm值，若OD450nm值0.029以上，说明样品中含有奥奈达希瓦氏菌。本发明专利技术方法具有较高的灵敏度，检测限为5.0×103cfu/ml，操作方便、迅速，可用于实地现场检测；且具有很好的特异性，检测结果几乎不受其他常见微生物的影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物检测领域，涉及。
技术介绍
奥奈达希瓦氏菌oneidensisMR-1, 51 oneidensis)属千 Y -变形菌纲的革兰氏阴性兼性厌氧菌，广泛存在于海水，海洋沉积物和淡水环境。在厌氧条件下，奥奈达希瓦氏菌能够在降解有机物的同时还原重金属离子。它在环境污染修复领域具有广泛的应用前景，例如它直接能够将水溶性的U (VI))还原成U (IV)。此外它还能还原硫代硫酸盐产生硫离子，继而与重金属离子结合形成硫化物沉淀。鉴于奥奈达希瓦氏菌在环境领域的应用前景，开发低成本的快速检测方法具有重要意义。目前，针对奥奈达希瓦氏菌的检测方法，有表面增强拉曼光谱法和微阵列杂交法。然而，这些方法不但操作复杂而且检测灵敏度较低。免疫磁分离技术是免疫学和磁性载体技术相结合而发展起来的一种新型富集分离技术。该技术采用的磁性微球包被有特异性抗体，可与相应的靶物质特异性结合形成免疫磁珠抗原复合物，通过外加磁场作用，免疫磁珠抗原复合物和溶液快速分离。因此，具有检测时间短、灵敏度较高和不受样品基质影响等优点。近年来，采用免疫磁分离技术与现代信号放大系统相结合的原理，开发了众多新型检测方法。例如，免疫磁珠分离技术与PCR、流式细胞术和ELISA等相结合。但是，这些方法具有检测时间长、成本高和需要复杂的仪器等。已有研究表明，奥奈达希瓦氏菌80%的膜结合的c型细胞色素位于细胞外膜，而且这些C型细胞色素与辣根过氧化物(HRP)具有相似的过氧化氢酶活性。对现有的技术检索发现，目前还没有针对奥奈达希瓦氏菌的免疫磁分离检测方法。因此，利用奥奈达希瓦氏菌细胞外膜过氧化氢酶活性，结合免疫磁珠分离技术，可以开发出一种新型的奥奈达希瓦氏菌的快速检测方法。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术能过研究，将基于奥奈达希瓦氏菌胞外过氧化氢酶活性的信号放大作用与免疫磁珠分离技术相结合进行创造性地结合，构建快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法，该方法具有特异性高，操作简单，检测迅速。本专利技术的目的在于提供一种免疫磁珠。本专利技术的另一目的在于提供快一种快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法。本专利技术所采取的技术方案是: 一种免疫磁珠，其制备方法包括以下步骤: O制备奥奈达希瓦氏菌特异性抗体； 2)将羧基化聚苯乙烯磁性微球活化，洗涤干净，然后与步骤I)中制备的奥奈达希瓦氏菌特异性抗体进行振荡孵育，使抗体与磁珠充分结合； 3)将孵育的磁珠洗涤干净，然后封闭，清洗干净，4°C保存，即可获得免疫磁珠。一种快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法，包括以下步骤: 1)将上述免疫磁珠加入待测样品溶液中，在18?27°C下振荡反应，使免疫磁珠上的抗体与奥奈达希瓦氏菌体抗原充分结合； 2)步骤I)中结合反应完成后，用磁铁将免疫磁珠与样品基质分开，去样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体； 3)将2)中得到的免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体洗涤干净，加入显色液，发生显色反应，使蓝色产物生成完全； 4)向蓝色产物中加入硫酸溶液终止显色反应，蓝色产物转化为黄色产物，检测其在450纳米处OD值，若OD值在0.029以上，说明此样品中含有奥奈达希瓦氏菌。进一步的，步骤I)中免疫磁珠与样品溶液体积比为(I?5):50。进一步的,步骤I)中所述振荡反应的时间为10?70min。进一步的,步骤3)中所述洗漆的具体过程为先用含4?6% (v/v)吐温20的PBS缓冲液洗涤3?4次，再用纯水洗涤干净。进一步的，步骤3)中所述显色液的体积与样品溶液体积的比为(0.8?1.2):5。进一步的，步骤3)中所述显色液含有的0.1?5mM过氧化氢，90?IlOmM柠檬酸钠，190?210mM磷酸氢二钠，0.3?0.35mM四甲基联苯胺，pH值为4?5。进一步的,步骤3)中所述显色反应时间为5?60min。本专利技术的有益效果是: (1)本专利技术所述的免疫磁珠具有完全超顺磁性，单分散性，悬浮性好； (2)奥奈达希瓦氏菌具有胞外过氧化氢酶活性，在过氧化氢存在下能够催化氧化四甲基联苯胺，产生蓝色反应产物，达到快速检测的目的； (3)本专利技术所述的奥奈达希瓦氏菌的检测方法具有较高的灵敏度，对奥奈达希瓦氏菌的检测限为5.0X IO3 cfu/ml，检测过程方便、迅速，可用于实地现场检测； (4)本专利技术所述的奥奈达希瓦氏菌检测方法具有很好的特异性，常见的其他微生物对检测几乎不产生影响。【附图说明】图1为免疫磁珠制备示意图； 图2为快速检测奥奈达希瓦氏菌的示意图； 图3为奥奈达希瓦氏菌和免疫磁珠复合体的光学显微镜头和扫描电镜图； 图4为奥奈达希瓦氏菌和免疫磁珠的类过氧化物酶活性检测； 图5为快速检测奥奈达希瓦氏菌的工作条件的优化； 图6为奥奈达希瓦氏菌检测的回归曲线； 图7为特异性实验结果图； 图8为样品基质成分对本专利技术检测方法的影响。【具体实施方式】免疫磁珠的制备 (1)制备免疫抗原:所述免疫抗原米用1%福尔马林灭活奥奈达希瓦氏囷液而制成； (2)制备奥奈达希瓦氏菌特异性抗体:所述奥奈达希瓦氏菌特异性抗体采用灭活免疫抗原免疫新西兰白兔方法得到抗血清，并且采用两步硫酸铵盐析法纯化抗血清，获得奥奈达希瓦氏菌特异性抗体； (3)制备免疫磁珠:所述免疫磁珠采用纯化的奥奈达希瓦氏菌特异性抗体与活化的羧基化聚苯乙烯磁性微球振荡孵育偶联制备而成； 快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法 1)将上述制备的免疫磁珠加到待测样品液中，室温(18?27°C)振荡反应10?70min，使免疫磁珠上的抗体与奥奈达希瓦氏菌体抗原充分结合；其中免疫磁珠与样品溶液体积比为(I ?5):50 ； 2)用磁铁将免疫磁珠与样品基质分开，去样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体； 3)将2)中得到的免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体洗涤干净,加入显色液,显色液的体积与样品溶液体积的比为(0.8?1.2):5，发生显色反应5?60min，使蓝色产物生成完全； 4)向蓝色产物中加入硫酸溶液终止显色反应，蓝色产物转化为黄色产物，检测其在450纳米处OD值，若OD值在0.029以上，说明此样品中含有奥奈达希瓦氏菌。优选的，步骤I)中免疫磁珠与样品溶液体积比为4:50。优选的，步骤I)中所述振荡反应的时间为50min。优选的，步骤3)中所述显色液的体积与样品溶液体积的比为1:5 优选的，步骤3)中所述洗涤的具体过程为先用含4?6% (v/v)吐温20的PBS缓冲液洗涤3?4次，再用纯水洗涤干净。优选的，步骤3)中所述显色液含有的0.1?5mM过氧化氢，90?IlOmM柠檬酸钠，190?2IOmM磷酸氢二钠，0.3?0.35mM四甲基联苯胺，pH值为4?5。最优选的，步骤3)中所述显色液含有2mM过氧化氢，IOOmM柠檬酸钠，200mM磷酸氢二钠，0.32mM四甲基联苯胺，pH为4.3。优选的，步骤3)中所述显色反应时间为30min。下面简要介绍一下本专利技术方法的技术原理: 在有奥奈达希瓦氏菌存在下，免疫磁珠与奥奈达希瓦氏菌发生抗原抗体结合形成免疫复合体；在外磁场作用下，免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体与样品基质分离，以移液器吸取样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体；用含有1%BSA的PB本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫磁珠，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：1）制备奥奈达希瓦氏菌特异性抗体；2）将羧基化聚苯乙烯磁性微球活化，洗涤干净，然后与步骤1）中制备的奥奈达希瓦氏菌特异性抗体进行振荡孵育，使抗体与磁珠充分结合；3）将孵育的磁珠洗涤干净，然后封闭，清洗干净，4℃保存，即可获得免疫磁珠。

【技术特征摘要】
1.一种免疫磁珠，其特征在于:其制备方法包括以下步骤: 1)制备奥奈达希瓦氏菌特异性抗体； 2)将羧基化聚苯乙烯磁性微球活化，洗涤干净，然后与步骤I)中制备的奥奈达希瓦氏菌特异性抗体进行振荡孵育，使抗体与磁珠充分结合； 3)将孵育的磁珠洗涤干净，然后封闭，清洗干净，4°C保存，即可获得免疫磁珠。2.一种快速检测奥奈达希瓦氏菌的方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将权利要求1所述的免疫磁珠加入待测样品溶液中，在18?27°C下振荡反应，使免疫磁珠上的抗体与奥奈达希瓦氏菌体抗原充分结合； 2)步骤I)中结合反应完成后，用磁铁将免疫磁珠与样品基质分开，去样品基质，得到免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体； 3)将2)中得到的免疫磁珠-奥奈达希瓦氏菌免疫复合体洗涤干净，加入显色液，发生显色反应，使蓝色产物生成完全； 4)向蓝色产物中加入硫酸溶液终止显色反应，蓝色产物转化为黄色产物，检测其在450纳米处OD值，若OD值在0.029以上，说明此样品中含有奥奈达希瓦氏菌。3.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：温俊林，周顺桂，陈俊华，
申请(专利权)人：广东省生态环境与土壤研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44