串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术为串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒，其检测快速、灵敏、准确、操作简便，适用于大批量样品的检测，为此本发明专利技术还提供了试剂盒的制备及检测方法。其特征在于：包括包被板、串珠镰刀菌素标准品、串珠镰刀菌素单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品；检测时取包被板，加入50μL的串珠镰刀菌素标准品或处理好的样品到微孔中，加50μL辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗鼠抗体，加50μL抗串珠镰刀菌素抗体，室温下反应30min，用洗涤液洗3次～5次，用吸水纸拍干，加50μL显色液A和50μL显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的串珠镰刀菌素含量。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术为串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒，其检测快速、灵敏、准确、操作简便，适用于大批量样品的检测，为此本专利技术还提供了试剂盒的制备及检测方法。其特征在于：包括包被板、串珠镰刀菌素标准品、串珠镰刀菌素单抗冻干品和酶标记的羊抗鼠抗体冻干品；检测时取包被板，加入50μL的串珠镰刀菌素标准品或处理好的样品到微孔中，加50μL辣根过氧化物酶（HRP）-羊抗鼠抗体，加50μL抗串珠镰刀菌素抗体，室温下反应30min，用洗涤液洗3次～5次，用吸水纸拍干，加50μL显色液A和50μL显色液B，暗处静置15分钟后加终止液，在450nm处测其吸光度值，从标准曲线计算样品中的串珠镰刀菌素含量。【专利说明】串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒
本专利技术属于食品安全检测领域，具体涉及食品中有害残留物质的检测方法，特别是一种串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒的专利技术。
技术介绍
串珠镰刀菌素是某些镰刀菌的代谢产物，因最初是由Cole等人于1973年自串珠镰刀菌的培养物中提取出来的，而被命名为串珠镰刀菌素串珠镰刀菌素。该菌素为水溶性，对动物各器官，特别对心血管有极强的毒性作用。串珠镰刀菌的化学名为3，4_ 二酮-1-羟基环丁烯，自然界中以钠盐或钾盐的方式存在。它是淡黄色针状结晶，具有水溶性。串珠镰刀菌素的毒性很强，小鸡经口 LD5tl为4.0 mg/kg。急性中毒的大鼠可导致进行性肌肉衰弱。呼吸困难，发绀，昏迷和死亡。有人认为某些疾病与摄食玉米有关。该毒素的毒理作用是选择性抑制氧化戊二酸盐脱氢酶和丙酮酸盐脱氢酶系统。Wilson等发现了串珠镰刀菌素的肝毒性和致肝癌性。在食品和饲料中，串珠镰刀菌素的检测方法有薄层色谱法，气象色谱法，气-质联机和高效液相色谱法。由于以上诸分析法样品前处理比较复杂，操作时需专门的技术人员、检测费用昂贵，不利于推广应用。
技术实现思路
本专利技术为串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量，操作简便，且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测，为此，本专利技术还提供了专用试剂盒的制备及检测方法。其特征在于:包有串珠镰刀菌素固相抗原的包被板制备(包括串珠镰刀菌素酶标二抗，洗涤液，显色液，终止液等的制备)，串珠镰刀菌素单克隆抗体的制备。串珠镰刀菌素一牛血清白蛋白偶联物的制备:将串珠镰刀菌素溶解在3 mL-100mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10 mL-100 mL蒸馏水，用氢氧化钠溶液调PH为8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20mL,弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调pH为2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到串珠镰刀菌素中间产物。取串珠镰刀菌素中间产物，加入3 mL-50 mL 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C _12°C下搅拌反应30分钟-45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5 mL-50 mL蒸馏水和5 mL-50 mL 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8_9，50C _12°C下搅拌反应5小时-6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次-5次，冷冻干燥，偶联物_20°C _40°C保存；上述反应成分的比例为:串珠镰刀菌素:羧甲基羟胺盐酸盐=(10-1000)mg:(10-2000)mg,串珠镰刀菌素中间产物:氯甲酸乙丁酯:BSA = (10-1000)mg:(10-1000) μ L:( 10-3000) mg。串珠镰刀菌素一卵清蛋白偶联物的制备:将串珠镰刀菌素溶解在3 mL-100 mL吡啶中，加入羧甲基羟胺盐酸盐，室温下搅拌过夜，氮气吹干，加入10 mL-100 mL蒸馏水，用氢氧化钠溶液调pH为8.5-9.5左右，再用二氯甲烷提取3次-5次，每次10 mL-20 mL,弃去二氯甲烷，水层用盐酸溶液调PH为2.5-3.5左右，再用二氯甲烷提取3次-6次，每次10 mL-20 mL，收集二氯甲烷，过无水硫酸钠脱水，过滤，低温用氮气吹干，得到串珠镰刀菌素中间产物；取串珠镰刀菌素中间产物，加入3 mL-50 mL 二氧六环，加入氯甲酸乙丁酯，5°C -12°C下搅拌反应30分钟-45分钟，将反应液滴加到牛血清白蛋白中，然后牛血清白蛋白溶于5 mL-50 mL蒸馏水和5 mL-50 mL 二氧六环中，用氢氧化钠溶液调pH为8_9，5°C - 12°C下搅拌反应5小时-6小时，然后，以蒸馏水进行透析，换液3次-5次，冷冻干燥，偶联物_20°C _40°C保存；上述反应成分的比例为:串珠镰刀菌素:羧甲基羟胺盐酸盐=(10-1000)mg:(10-2000)mg,串珠镰刀菌素中间产物:氯甲酸乙丁酯:0VA = (10-1000)mg:(10-1000) μ L:( 10-3000) mg。所述抗串珠镰刀菌素单克隆抗体及其溶液的制备:取串珠镰刀菌素一牛血清白蛋白偶联物用生理盐水配成0.1 μ g/μ L抗原溶液，与等体积完全福氏佐剂混匀，充分乳化，供首次免疫用，加强免疫时用同量的不完全福氏佐剂代替完全福氏佐剂，首次免疫采用小鼠腹腔内直接注射，免疫剂量为10 μ g/只-100 μ g/只小鼠，以后每隔2周-4周加强免疫一次，加强免疫采用尾静脉注射，免疫剂量10 μ g/只-100 μ g/只，最后一次免疫采用脾内注射，4天后取脾融合，将分离的免疫小鼠脾细胞与处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0以10:1比例混合，离心，去除上清，在50 s-90 s内将0.1 mL-10 mL 50%聚乙二醇(分子量为1500)加至细胞中，充分混匀，使其融合，I分钟-3分钟后加入10 mL-50 mL DMEM培养液，终止融合，水浴静止10分钟-30分钟后离心，去除上清；将融合细胞用含5-30%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，以最后浓度为I X IO4-1 X IO6饲养细胞接种于小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于5%-10% CO2, 350C _45°C条件下培养，5天-10天后，每培养孔更换 HT培养液。10天-20天后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果。阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆，杂交瘤筛选采用固相抗原间接非竞争ELISA法 进行，以串珠镰刀菌素一卵清蛋白偶联物为包被抗原，以免疫小鼠的血清为阳性对照，以SP2/o骨髓瘤细胞培养的上清液为阴性对照；阳性细胞孔的判定标准为(A试验-A空白)代A对照-A空白)>2.1 ;对分泌阳性抗体的细胞进行克隆；采用有限稀释法，将阳性克隆细胞吹匀，取一滴至培养瓶内，倒置显微镜下准确计数细胞个数，稀释为70个/mL，再取I mL稀释20倍，接种入96孔培养板中进行亚克隆，直至所有细胞孔的培养上清均呈阳性为止；对10周龄-13周龄BALB/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.3 mL/只-0.5 mL/只，8天-10天后，腹腔注射培养至对数期的杂交瘤细胞，5 X IO6细胞/只，5天后注意观察，收集腹水，离心去除沉淀，加甘油于_20°C~_40°C保存；上述反应成分的比例为:串珠镰刀菌素一牛血清白蛋白偶联物:生理盐水=(本文档来自技高网...

【技术保护点】
串珠镰刀菌素酶联免疫检测试剂盒的制备，包括洗涤液，显色液，终止液；其特征在于：包有串珠镰刀菌素固相抗原的包被板、串珠镰刀菌素标准品，串珠镰刀菌素单克隆抗体、串珠镰刀菌素酶标二抗。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜道林，尚苏林，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32