检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，包括有：针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。本发明专利技术采用特异性的引物、荧光探针及优化的检测体系，既可单独也可同步检测上述三种基因型，且检测线性广，以25μL检测体系可检测2ng-600ng人基因组DNA；准确性高，检测结果与金标准测序方法100％一致。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测领域，具体涉及用于一种用于检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性的探针和试剂盒。
技术介绍
华法林(Warfarin)属香豆素类口服抗凝血药，是用于治疗血液栓塞性疾病(如心脏瓣膜置换术后、心房颤动、静脉血栓形成及肺梗塞等)的一线药物。CYP2C9是华法林的主要代谢酶，其SNP的某些基因型会造成CYP2C9的酶活下降，以致华法林在体内的清除减慢。华法林是通过抑制维生素环氧化物还原酶(VKOR)，使维生素K参与的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ合成受阻，从而发挥抗凝作用，因此VKOR的一个重要亚单位基因(VKORC1)的SNP亦会造成个体对华法林的敏感性存在明显差异。加之华法林的治疗窗较窄，很少的剂量变化也可能导致血栓或出血，因此在临床应用上，相关基因的单核苷酸多态性检测可作为个性化治疗的给药依据。目前，对基因多态性的检测分析技术方法主要包括：ARMS荧光PCR法,基因测序、限制性片段长度多态性方法(RFLP)、基因芯片等方法。这些方法都有各自的优点和缺陷，尚有待改进和标准化。1、ARMS荧光PCR法：扩增阻碍突变系统(Amplification refractory mutation system，ARMS)利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出基因突变。2、直接测序：Sanger测序法因为可以读到DNA每个碱基的变化，目前被认为是检测基因突变的金标准方法。缺点是测序步骤繁琐、耗时长，对设备和操作人员的要求较高，检测周期长，多限于在科研单位进行，大多数医院都无法独立完成检测，较难形成标准化操作、适合临床单位应用的体外诊断产品。3.限制性片段长度多态性方法(RFLP)：该方法成本低，对检测设备要求低，突变基因的检出限在5～10％。但是，劳动强度稍大、需专业的技术人员、不适于高通量检测和大规模临床应用。4.基因芯片法：该方法是将探针固定于支持物上，如玻片或膜，通过PCR方法扩增出靶基因，再通过杂交手段进行芯片杂交，应用仪器进行结果判读。该方法可以进行高密度基因检测，但成本高、操作繁琐、检测流程相对较长，在市场推广上将受到一定限制。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种特异性高的检测人类CYP2C9和VKORC1基因多态性试剂盒，该试剂盒既能实现CYP2C9基因*2(C430T)位点、*3(A1075C)位点和VKORC1基因(G-1639A)的基因型的单独检测，又能实现上述三个位点的并行检测。实现上述目的的技术方案如下。一种检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，包括有：针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。在其中一个实施例中，所述针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。在其中一个实施例中，所述针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。在其中一个实施例中，所述针对VKORC1基因扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。在其中一个实施例中，还包括有UNG酶。在其中一个实施例中，检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，包括有针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2以及碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5以及碱基组成如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和针对VKORC1基因G-1639A位点的扩增引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8以及碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。本专利技术的另一目的还提供用于检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的检测探针。具体技术方案如下。用于检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的检测探针，包括有针对CYP2C9基因C430T位点的碱基组成如SEQ ID NO:3所示的探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的碱基组成如SEQ ID NO:6所示探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的碱基组成如SEQ ID NO:9所示的探针。本专利技术采用的具体技术原理是在每个检测靶点的PCR体系中，加入一对非等量的特异性引物和一条覆盖SNP位点的荧光探针。首先通过不对称PCR扩增出含检测位点的单链寡核苷酸靶序列，其后运行熔解曲线荧光采集程序。从低温到高温的熔解过程中，荧光探针与单链靶序列形成的杂交产物从互补配对到解链变性，期间的荧光值变化记录为熔解曲线。将熔解曲线对温度作一阶负导数可获得杂交产物的熔解峰图，并计算出相应的熔点(Tm值)。由于SNP位点的碱基变化不同，导致靶序列与探针的匹配程度不一，因此杂交产物的温度稳定性及熔解行为各有差异。若单链靶序列中只有1种等位基因，并与探针完全匹配，则只有1个熔解峰，其Tm值较高；反之，单一熔解峰的Tm值较低；若靶序列含有2种等位基因，则会出现2个熔解峰，Tm值分别与两种纯合等位基因的熔解峰的Tm值一致。通过对熔解峰图的分析可对检测位点基因型进行判读。本专利技术的主要有益效果如下：(1)采用特异性的引物、荧光探针及优化的检测体系，既可单独也可同步检测CYP2C9基因*2(C430T)位点、*3(A1075C)位点和VKORC1基因(G-1639A)的基因型，且检测线性广，以25μL检测体系可检测2ng-600ng人基因组DNA；准确性高，检测结果与金标准测序方法100％一致。(2)闭管操作，检测速度快，检测过程只需90分钟即可完成。(3)抗污染，试剂盒中含有UNG酶，可以消除由于PCR产物导致的污染。附图说明图1为实施例2对CYP2C9*2(C430T)位点进行检测，不同基因型所检测结果示意图。图2为实施例3对CYP2C9*3(A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，其特征在于，包括有：针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和/或针对VKORC1基因G‑1639A位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。

【技术特征摘要】
1.一种检测人类CYP2C9和/或VKORC1基因多态性的试剂盒，其特征在
于，包括有：针对CYP2C9基因C430T位点的扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:
3所示的荧光检测探针、针对CYP2C9基因A1075C位点的扩增引物和碱基组成
如SEQ ID NO:6所示荧光检测探针、和/或针对VKORC1基因G-1639A位点的
扩增引物和碱基组成如SEQ ID NO:9所示的荧光检测探针。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对CYP2C9基因
C430T位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对CYP2C9基因
A1075C位点的扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述针对VKORC1基因
扩增引物的碱基组成如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括有针对
CYP2C9基因C430T位点的扩增引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2以及碱基
组成如SEQ ID NO:3...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾庆，张中满，张亚旭，张颖芬，
申请(专利权)人：广州好芝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44