一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用。该方法以公猪全基因组DNA为模板，通过PCR扩增KDM5B基因，随后进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳结果鉴定KDM5B基因在NC_010452.3:g.52599_52633位点存在35‑bp插入/缺失多态性。KDM5B基因35‑bp插入/缺失多态性不同基因型与40日龄长白猪公猪睾丸短轴长、睾丸重等繁殖性状之间显著相关，KDM5B基因35‑bp插入/缺失多态性位点能够作为提高长白猪公猪繁殖性状的分子标记，故本发明专利技术有利于长白猪公猪繁殖性状的标记辅助选择(MAS)，有利于快速建立遗传资源优良的公猪种群。

【技术实现步骤摘要】
一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法及其应用
本专利技术属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失多态性的检测，特别涉及一种快速、准确检测公猪KDM5B基因NC_010452.3:g.52599_52633位点35-bp插入/缺失多态性的方法。
技术介绍
猪作为中国人最主要的肉类消费品，在中国存栏量巨大。培育具有优良生产性状的种质资源是供给充足猪肉的保障。通过研究猪基因组遗传信息，寻找与繁殖性能、抵抗力、畜产品品质、饲料转化率等性状相关基因的多态性，并将这些基因多态信息应用在猪分子育种领域，有利于培育和改良出更多具有优良生产性能的品种。猪是一种重要的模式动物，应用在人类疾病研究和器官移植等领域。同时猪也是一种重要的经济动物，全球猪肉产量在过去十年上涨60％，目前猪肉占全球肉产品总量的三分之一左右。农业部公布的数据显示，2015年全国生猪出栏量为70,825万头，猪肉产量达到5,487万吨，占年肉产品总产量的65％，占全球猪肉总产量的49.9％，总产值为13,325亿元。在我国，大力发展养猪业不仅能满足人民日益增长的消费需求，也可以促进经济的快速发展。提供足够数量和质量的畜产品需要优良的种质资源作为保证，而育种技术关系到培育品种是否优良。相对于以表型和表型值为基础的传统育种方法，运用以DNA多态为基础的分子育种技术，可以对那些传统育种方法难以进行选择的重要经济性状(繁殖性状、畜产品品质性状等)进行改良。得益于近几十年来生物学技术的快速发展，分子标记辅助选择(marker-assistedselection，MAS)已经成为现代育种技术体系的重要组成部分。该技术首先检测重要基因的DNA多态性，随后分析DNA多态与遗传性状之间的相关性，最后挑选与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择。MAS技术可以在DNA水平上快速准确地分析个体遗传组成，提高家畜育种的定向性，育种值估计的准确性，缩短培育年限。MAS极大地推动了分子育种技术的发展。寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点、分析重要功能基因遗传变异位点与生长性能的相关性，是MAS技术应用的前提和关键。目前，很多分子遗传标记已经应用在分子育种领域，而新一代的遗传图谱标记仍在不断地被发掘。天然的遗传变异形式可以归纳为以下三种，单核苷酸多态(SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs)、插入/缺失(InsertionsandDeletions，Indels)以及基因组结构变异(StructuralVariations，SVs)。Indel是指在近缘物种或同一物种不同个体之间基因组同一位点的序列发生不同大小核苷酸片段的插入或缺失。目前将Indel定义为50bp以下插入和缺失的总称。尽管Indel在人类基因组所有染色体上均有分布，且含量仅次于SNPs，但对它的研究程度远不如SNPs和SVs深入。Indel可以划分为5个主要类别：①单个碱基对的插入或缺失；②只一个碱基对的扩增；③2-15bp的扩增；④转座子插入；⑤随机DNA序列的插入或缺失。其中第五类Indel所占比例最高，转座子插入所占比例最少。2006年，Devine等首次在人类基因组上确定并定位了415436个Indel序列。2008年，Kidd等在人类基因组上报道了796273个Indel序列。但两个实验团队得到的序列只有10％是相同的，这样低的重复率说明Indel序列还远远没有被完全发现。截止2015年，千人基因组计划(The1000GenomesProject)宣布在人类基因组上发现360万个Indel序列。Indel通过改变DNA序列影响相关因子与DNA的结合，或影响RNA序列，又或影响RNA剪接位点等方式改变基因表达。在已知的Indel序列中，只有一小部分长度偏短的序列位于编码区域，这些序列大多会影响基因表达。有些位于启动子区的Indel可以改变DNA序列的相位与间隔，影响相关因子与DNA结合。出现在转录因子结合区域或者增强子区域的Indel，可能会抑制甚至终止基因表达。目前已经发现Indel能够改变人类表型导致疾病。在基因突变导致的人类疾病中，至少有1％由Indel引起。例如CFTR基因三个碱基对删除导致囊性肺纤维病变；FMR1基因启动子区三倍重复扩增导致脆性X综合征；在血友病、多发性神经纤维瘤和癌症患者基因组中发现存在转座子插入。近几年《GenomeResearch》等杂志报道了Indel在物种进化方面的研究，发现Indel是造成物种间基因组多样性的原因之一，并认为其可能在生物进化中扮演重要角色，促进物种形成。与其他分子标记相比，基因组同一位点发生相同长度Indel突变的概率小，可看作同一来源，所以Indel标记准确性高、变异稳定，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊。与SNPs分型系统相比，Indel分型技术对设备和技术要求较低，更简便。目前，Indel在作物育种领域有较多应用。鉴定粳稻与籼稻在水稻育种中具有重要价值。通过对不同品种水稻相关Indel位点等位基因频率进行分析，不仅能准确鉴定水稻粳、籼属性，也有利于籼粳杂交稻的培育。Hayashi等将抗稻瘟品种与不抗稻瘟品种作为双亲，杂交后分析比对子代水稻相关基因序列，由此开发的Indel标记可以筛选抗瘟水稻。此外，Indel分子标记广泛应用在其他作物育种领域，如栽培番茄、黄瓜等。近年来，Indel在家畜育种领域越来越受到重视。研究显示，一些位于生产性状相关基因上的Indel序列，会显著影响相关基因的表达。繁殖方面，猪Tex14基因27外显子上存在一段51bp的插入序列，该插入序列会导致猪生精障碍。约克夏猪催乳素受体基因3’非翻译区(3’-UTR)存在一段Indel序列，若该序列存在，会使催乳素受体基因的表达下调75％。日本和牛雌激素受体2A基因上游序列存在一段3bpIndel，该序列存在会促进雌激素受体的转录，提高雌性个体的生殖能力。生产方面，二酰基甘油酰基转移酶基因3’-UTR存在一段13bp的Indel序列。该序列存在时，二酰基甘油酰基转移酶的表达明显升高，提高猪脂肪沉积能力，使背膘增厚、瘦肉率降低。通过研究家畜基因组遗传信息，人们能够发现影响性状基因的变异位点，这些变异位点的鉴定对家畜育种具有重要意义。赖氨酸特异性去甲基化酶5B(Lysine(K)-SpecificDemethylase5B，KDM5B)基因又称JARID1B或PLU-1，该基因编码一个能够使组蛋白H3K4一甲基化(me1)、二甲基化(me2)和三甲基化(me3)去甲基化的酶。通常认为，组蛋白H3K4甲基化标记可以促进基因转录，KDM5B作为去甲基化酶去除组蛋白甲基化标记，会抑制一些基因的转录。猪KDM5B基因位于10号染色体上，基因全长85905bp，编码的蛋白含1552个氨基酸残基，属于含有JmjC结构域的组蛋白赖氨酸去甲基化酶。KDM5B结构域从N端到C端依次是：JmjN，ARID，PHD1，JmjC，锌指结构域，PLU1，PHD2和PHD3。在这些结构域中，JmjN和JmjC两个结构域参与组蛋白H3K4甲基化标记的去除。ARID结构域是一个DNA结合结构域，结合CCGCCC和GCACC序列。PLU1是一本文档来自技高网...

【技术保护点】
公猪KDM5B基因存在的35‑bp插入/缺失多态性位点：NC_010452.3:g.5259952633delAAGCTGATCATTCAGCATACCATTGATCCAGAGGG，在公猪分子标记辅助选择育种中应用。

【技术特征摘要】
1.公猪KDM5B基因存在的35-bp插入/缺失多态性位点：NC_010452.3:g.5259952633delAAGCTGATCATTCAGCATACCATTGATCCAGAGGG，在公猪分子标记辅助选择育种中应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型可以作为提高长白猪公猪繁殖性状的分子标记。3.一种公猪KDM5B基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：以公猪全基因组DNA为模板，引物对P1为引物，通过PCR扩增公猪KDM5B基因片段；再对PCR扩增得到的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果确定公猪KDM5B基因上插入/缺失多态位点的基因型；所述的引物对P1为：上游引物：5’-GGC...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘传英，崔洋，于帅，陈瑞，曾文先，董武子，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西,61