一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒及其应用。本发明专利技术盒体内的物质包括检测PEAR1基因上的rs2768759号位点的特异性引物及特异性荧光探针、rs12041331号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水。本发明专利技术克服了过去基因突变检测的诸多方法中各自存在的缺陷。本发明专利技术检测准确性高、检测简单方便、检测时间短、结果分析简单的优点，能够对PEAR1基因rs2768759号和rs12041331号两个多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行PCR荧光扩增反应，只需根据两种不同的荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，提高效率降低检测成本，无需DNA提取，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学领域临床检测技术中的基因检测技术，特别涉及一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒及其应用。
技术介绍
血小板内皮聚集受体1(PEAR1)，一种新发现跨膜蛋白，参与了诱导血小板接触性激活过程。胶原作用于血小板之后，PEAR1胞质内酷氨酸及丝氨酸残基磷酸化，从而使相互接触的血小板形成更称稳定的血栓。PEAR1可以同时调节CRP-XL和二磷酸腺苷(adenosinediphosphate，ADP)形成通路，通路与PEAR1基因的rs2768759号和rs12041331两个SNP位点相关，其基因多态性均可能影响抗血小板聚集药物(如阿司匹林等)的抗血小板作用。通过对PEAR1基因多态性的检测，可以更好的了解患者对抗血小板聚集药物的治疗效果。在本专利技术作出之前，目前进行基因突变检测的方法有数十种。金标准法为基因测序法。基因测序法是目前应用最广泛、较准确的一种方法，但是该方法需要昂贵的仪器设备和专业的人员进行操作，费时费力，在临床上很难进行推广。基因芯片法具有快速高通量的优点，但是操作上复杂，步骤多，成本高也不易普及。以限制性酶切片段长度多态性(RFLP)检测基因突变的方法具有成本低廉的优点，但是过程烦琐，时间长也不适合普及。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述缺陷，研制一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒及其应用。本专利技术的技术方案是：一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其主要技术特征在于：所述盒体内的物质包括检测PEAR1基因上的rs2768759号位点的特异性引物及特异性荧光探针、rs12041331号SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；所述PEAR1基因上的rs2768759号位点特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：正义引物：5’-CCACCCTCAGCCCTATCACT-3’，反义引物：5’-AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3’；所述PEAR1基因上的rs12041331号位点特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：野生型探针：5’-FAM-CACCTGTCCAGTTCC-MGB-3’突变型探针：5’-HEX-CACCTGTCCCGTTCC-MGB-3’；所述PEAR1基因上的rs12041331号位点特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：正义引物：5’-GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC-3’，反义引物：5’-GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA-3’；所述PEAR1基因上的rs2768759号位点特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：野生型探针：5’-FAM-TCTCACTTCCATCACC-MGB-3’突变型探针：5’-HEX-TCTCACTTCCGTCACC-MGB-3’。所述盒体中各物质的含量为：浓度为10μM的特异性引物共0.45μl，其中正义引物和反义引物各0.225μl；浓度为5μM的特异性荧光探针共0.2μl，其中野生型探针和突变型探针各0.1μl；浓度为5单位/μl的TaqDNA聚合酶0.02μl；浓度为20mM的dNTP混合液0.1μl；浓度为25mM的MgCl2溶液0.5μl；5X荧光定量PCR反应缓冲液2μl；去离子水4.73μl。所述检测rs2768759号位点特异性引物中，正义引物的Tm值为58.4℃，反义引物的Tm值为58.3℃；所述特异性荧光探针中，野生型探针的Tm值为69℃，突变型探针的Tm值为68℃；所述检测rs12041331号位点特异性引物中，正义引物的Tm值为58.7℃，反义引物的Tm值为59.1℃；所述特异性荧光探针中，野生型探针的Tm值为66℃，突变型探针的Tm值为66℃。所述试剂盒的保存温度为-20℃。本专利技术另一技术方案是：一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒的应用，其物征在于：所述试剂盒用于检测PEAR1基因上rs2768759号和rs12041331号SNP位点的基因型。本专利技术与现有技术相比，优点在于检测准确性高、检测简单方便、检测时间短、结果分析简单的优点，适合临床实验室使用：(1)利用本专利技术试剂盒能够对PEAR1基因rs2768759号和rs12041331号两个多态性位点进行定性检测，根据SNP位点进行PCR荧光扩增反应，只需根据两种不同的荧光曲线是否起线就能进行结果判断，不会产生人为误差，假阳性和假阴性率低，提高效率降低检测成本。(2)无需DNA提取，只需裂解全血细胞，将细胞裂解后的悬液加入反应体系即可完成扩增，免去DNA提取的步骤和成本并避免气溶胶污染，提高检测效率和准确度，缩短检测时间。(3)本专利技术试剂盒所使用的荧光检测探针为Taqman探针，该探针费用低廉；同时本专利技术所有的反应全程闭管操作，PGR反应后不需要进行PCR产物纯化、电泳、酶切、杂交等，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测的效率，另外降低了PCR产物污染引起假阳性的风险。附图说明图1——PEAR1基因上rs2768759号SNP位点纯合野生型扩增曲线示意图。图2——PEAR1基因上rs2768759号SNP位点杂合型扩增曲线示意图。图3——PEAR1基因上rs2768759号SNP位点纯合突变型扩增曲线示意图。图4——PEAR1基因上rs12041331号SNP位点纯合野生型扩增曲线示意图。图5——PEAR1基因上rs12041331号SNP位点杂合型扩增曲线示意图。图6——PEAR1基因上rs12041331号SNP位点纯合突变型扩增曲线示意图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒，试剂盒中包括以下PEAR1基因rs2768759号和rs12041331号两个多态性位点的扩增特异性引物1对及2条特异性荧光探针。用于检测PEAR1基因上的rs2768759号位点特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：正义引物：5’-CCACCCTCAGCCCTATCACT-3’，反义引物：5’-AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3’；用于检测PEAR1基因上的rs12041331号位点特异性荧光探针包括野生型本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其特征在于：所述盒体内的物质包括检测PEAR1基因上的rs2768759号和rs12041331两个SNP位点的特异性引物及特异性荧光探针、Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液和去离子水；所述PEAR1基因上的rs2768759号位点特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：正义引物：5’‑CCACCCTCAGCCCTATCACT‑3’，反义引物：5’‑AGATTGAATCATGGGAGTGGG‑3’；所述PEAR1基因上的rs12041331号位点特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：野生型探针：5’‑FAM‑CACCTGTCCAGTTCC‑MGB‑3’突变型探针：5’‑HEX‑CACCTGTCCCGTTCC‑MGB‑3’；所述PEAR1基因上的rs12041331号位点特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：正义引物：5’‑GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC‑3’，反义引物：5’‑GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA‑3’；所述PEAR1基因上的rs2768759号位点特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，它们的序列为：野生型探针：5’‑FAM‑TCTCACTTCCATCACC‑MGB‑3’突变型探针：5’‑HEX‑TCTCACTTCCGTCACC‑MGB‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种检测人类PEAR1基因多态性的试剂盒，包括盒体和装于盒体内的物质，其特征在
于：所述盒体内的物质包括检测PEAR1基因上的rs2768759号和rs12041331两个SNP位点的
特异性引物及特异性荧光探针、TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应
缓冲液和去离子水；
所述PEAR1基因上的rs2768759号位点特异性引物中的正义引物和反义引物的序列为：
正义引物：5’-CCACCCTCAGCCCTATCACT-3’，
反义引物：5’-AGATTGAATCATGGGAGTGGG-3’；
所述PEAR1基因上的rs12041331号位点特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探
针，它们的序列为：
野生型探针：5’-FAM-CACCTGTCCAGTTCC-MGB-3’
突变型探针：5’-HEX-CACCTGTCCCGTTCC-MGB-3’；
所述PEAR1基因上的rs12041331号位点特异性引物中的正义引物和反义引物的序列
为：
正义引物：5’-GGTGAGGGGTTATCCTATGCTAC-3’，
反义引物：5’-GATTAGAGTTCCTGGTGGACAAGA-3’；
所述PEAR1基因上的rs2768759号位点特异性荧光探针包括野生型探针和突变性探针，
它们的序列为：
野生型探针：5’-FAM-TCTCACTTCCATCACC-MGB-3’
突变型探针：5’-HEX-TCTCACTTCCGTCACC-MGB...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐运，邵渊，张希根，
申请(专利权)人：南京仁天生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32