一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物及应用制造技术

本发明专利技术属于生物检测医学分子技术领域，涉及一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物及应用，具体涉及一种用于FokI(rs2228570)这个SNP位点核苷酸多态性的检测引物及应用，所述扩增引物包括根据FokI(rs2228570)位点的单核苷酸多态性设计的特异性引物。本发明专利技术方法采用限制性内酶切的方法检测VDR基因准确性高，结果直观，特异性好，假阳性假阴性率低，是一种判断儿童钙吸收的简单准备的新方法，不仅如此，本发明专利技术所提供的用于检测儿童钙吸收基因型多态性的PCR扩增引物、检测试剂盒及其检测方法具有很高的应用价值，操作简单方便，一起设备要求低，适应性广，特别适合推广应用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物及应用
本专利技术属于生物检测医学分子
，涉及一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物及应用，具体涉及一种用于FokI(rs2228570)这个SNP位点核苷酸多态性的检测引物及应用。
技术介绍
钙是人体所必需的矿物质营养素，所有的细胞都需要钙。人类的健康离不开钙。人体内99％以上的钙都分布于骨骼和牙齿中,其余的1％中一半与蛋白质结合，一半以离子状态存在于软组织、细胞外液及血液。这部分钙与骨骼钙维持动态平衡，是维持体内正常状态所必需的。体内有相当强大保留钙和维持细胞外液中钙浓度的机制，因为钙生理学功能对生命非常重要，即使当饮食钙严重缺乏或机体发生钙异常丢失时，可通过相同机制使骨脱矿化，以纠正甚至是轻微低钙血症，而保持血钙稳定。影响人体每日吸收的钙数量最决定性的器官就是小肠，维生素D所刺激产生的Ca运输蛋白(TRPV-5,TRPV-6)，会将在小肠内腔的Ca离子主动运输至小肠的绒毛细胞(enterocytecell)内，绒毛细胞再将钙离子经由钙泵运输到血液中。维生素D，又通称为可以帮助生物体吸收钙质的固醇类物质，在小肠对钙的吸收中扮演重要的角色，它可增加小肠细胞膜和细胞质的钙结合蛋白质的总量。维生素D缺乏的儿童会因为钙吸收不足而易患有软骨病。基因检测已被证明是预测儿童天赋的有效手段。通过对钙吸收相关某些基因的检测可以对钙吸收进行预测。帮助家长提早发现孩子可能存在的钙吸收高风险情况，从而引起足够的重视。VDR是维生素D受体(VitaminDreceptor)，其作用是结合在Ca运输蛋白基因的上游转录调控元件上，在肾脏中VDR会调节维生素D与Ca运输蛋白基因进一步结合，将其磷酸化，制造出Ca运输蛋白，帮助人体从小肠中吸收钙离子。因此VDR基因的多态性与钙吸收率有显著的相关性。CN103255211A公开了一种预测优秀冰雪运动员身高的分子生物学方法。通过检测维生素D受体基因遗传多态性，即对维生素D受体基因BsmI、ApaI和FokI三个单核苷酸多态性位点的基因型进行命名并检测相应基因型的概率来预测优秀冰雪运动员的最适身高，但其并没有公开可用于检测钙吸收的情况。目前检测单核苷酸多态性的常用方法有PCR-RFLP、基因芯片，sanger测序等方法。PCR-RFLP操作复杂耗时，并且结果可信度差。PCR-RFLP扩增条件要求严格，操作繁琐。基因芯片快速高效，但其造价高。Sanger测序费用较高，且杂合体不易分型。目前市场上儿童补钙的产品很多，但补充钙后儿童能不能很好的吸收钙也至关重要，因此检测VDR基因至关重要。
技术实现思路
本专利技术为了克服上述方法的缺陷，提供一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物及应用，本申请方法采用限制性内切酶的方法检测VDR基因上的单核苷酸多态性，准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低，操作简单方便，仪器设备要求低，适应性广。为达到此专利技术的目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括根据FokI(rs2228570)位点的单核苷酸多态性设计的特异性引物。本专利技术中，VDR基因上的一个单核苷酸多态性位点rs2228570的多态性与钙吸收高度相关，采用限制性内酶切的方法检测VDR基因准确性高，特异性好，假阳性假阴性率低。根据本专利技术，所述FokI(rs2228570)位点的特异性引物的核酸序列如SEQIDNO.1-2所示；FokI(rs2228570)上游引物(SEQIDNO.1)：GCGGAACAGCTTGTCCACCC；FokI(rs2228570)下游引物(SEQIDNO.2)：GCTCAGAACTGCTGGAGTGG。第二方面，本专利技术提供了检测儿童钙吸收基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的扩增引物。根据本专利技术，所述试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性内切酶。本专利技术中，所述缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性内切酶都是常规的PCR试剂，本领域技术人员可以根据需要对浓度进行调节，在此不做特殊限定。第三方面，本专利技术提供一种儿童钙吸收基因多态性的检测方法，所述检测方法包括使用如第一方面所述的扩增引物或如第二方面所述的试剂盒。根据本专利技术，包括如下步骤：(1)采集待检样本，提取样本DNA；(2)使用如权利要求1或2所述扩增引物进行PCR扩增反应；(3)使用限制性内切酶处理步骤(2)得到的扩增产物；(4)向步骤(3)处理后的扩增产物进行凝胶电泳分析。根据本专利技术，步骤(1)所述的提取样本DNA的具体步骤如下：取口腔黏膜样本，加入蛋白酶K，45-53℃水浴过夜，煮沸5-15min，置于冰上1-5min，1000-15000r/min离心1-5min，取上清液，即得所述待测样本DNA。所述的水浴温度例如可以是45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃或53℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述煮沸时间例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min或15min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述置于冰上的时间例如可以是1min、2min、3min、4min或5min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述离心的转速例如可以是10000r/min、11000r/min、12000r/min、13000r/min、14000r/min或15000r/min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。所述离心的时间例如可以是1min、2min、3min、4min或5min，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。本专利技术中，所述蛋白酶K的浓度为10-30mg/mL，例如可以是10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、20mg/mL、22mg/mL、23mg/mL、25mg/mL、26mg/mL、28mg/mL或30mg/mL，优选为15-25mg/mL，进一步优选为20mg/mL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本专利技术不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。在本专利技术一个具体实施例中，所述提取样本DNA的具体步骤如下：取口腔粘膜拭子，在口腔内侧反复擦拭二十下，取出拭子折下棉絮部分，置于Chelex100液150μl的1.5ml离心管中，使其浸没标本，加入20mg/mL蛋白酶K20μL，50℃水浴过夜，煮沸10min，置于冰上3min，12000r/min离心2min，取上清液，即得所述待测样本DNA。本专利技术中，所述Chelex100液，按照5％(w/v)的浓度配置。根据本专利技术，步骤(2)所述PCR扩增反应的条件为：(a)94℃预变性1min，1循环；(b)95℃变性30s、60℃退火30s、72℃延本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括根据FokI(rs2228570)位点的单核苷酸多态性设计的特异性引物。

【技术特征摘要】
1.一种检测儿童钙吸收基因多态性的扩增引物，其特征在于，所述扩增引物包括根据FokI(rs2228570)位点的单核苷酸多态性设计的特异性引物。2.根据权利要求1所述的扩增引物，其特征在于，所述FokI(rs2228570)位点的特异性引物的核酸序列如SEQIDNO.1-2所示。3.一种检测儿童钙吸收基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的扩增引物。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和限制性内切酶。5.一种儿童钙吸收基因多态性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括使用如权利要求1或2所述的扩增引物或如权利要求3或4所述的试剂盒。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)采集待检样本，提取样本DNA；(2)使用如权利要求1或2所述扩增引物进行PCR扩增反应；(3)使用限制性内切酶处理步骤(2)得到的扩增产物；(4)向步骤(3)处理后的扩增产物进行凝胶电泳分析。7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)所述的提取样本DNA的具体步骤如下：取口腔黏膜样本，加入蛋白酶K，45-53℃水浴过夜，煮沸5-15min，置于冰上1-5min，10000-15000r/min离心1-5min，取上清液，即得所述待测样本DNA；优选地，所述蛋白酶K的浓度为10-30mg/mL，优选为15-25mg/mL，进一步优选为20mg/mL。8.根据权利要求5-7中任一项所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增反应的条件为：(a)94℃预变性1min，1循环；(b)95℃变性30s、60℃退...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏飞，王菁蕊，段婷，韩雪，
申请(专利权)人：天津脉络医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12