扩增甲基化核酸或非甲基化核酸的方法技术

本发明专利技术的课题在于，提供能够将生物学试样中存在的甲基化核酸和非甲基化核酸两者扩增，进而能够适当调节甲基化核酸和／或非甲基化核酸的扩增率的基因扩增方法。该课题通过如下的扩增方法解决，即，使用与甲基化和非甲基化核酸都能杂交的非特异性引物、及与甲基化或非甲基化核酸特异性杂交的特异性引物的扩增方法；进而，通过使这些引物的混合率发生变化而使甲基化核酸或非甲基化核酸的扩增率发生变化的扩增方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及扩增存在于生物学试样中的甲基化核酸或非甲基化核酸的方法。进而，涉及包含该扩增方法的方法，该方法检测生物学试样中可能含有的目标基因和/或基 因位点中的甲基化和/或非甲基化。 本申请基于作为参照而援引于此的日本专利申请特愿2007-153086号请求优先 权。
技术介绍
在哺乳类中，在存在于基因组DNA序列中的5'-CG-3'DNA部分(以下，称为CpG部 位，或简单称之为CpG)中，已知位于该鸟嘌呤(G)的5'侧的胞嘧啶(C)被甲基化的现象。 CpG的甲基化修饰被认为会对基因表达产生影响。特别是在富含CpG的区域(CpG岛)存在 于基因的启动子区域内时，CpG被认为会对基因表达产生重要影响。 通常，染色体中的多数CpG岛因甲基化而被保护。但是，由于某些原因，如果存在 于启动子区域的CpG岛被甲基化，则该基因的转录受到抑制。例如，在人体内的抑癌基因 中，发生存在于其启动子区域的CpG岛的异常甲基化，该抑癌基因的转录被钝化时，细胞增 殖的控制变得无效，从而导致癌等细胞增殖性疾病发生。 另一方面，在CpG岛以外的区域中，通常CpG中的胞嘧啶被甲基化。但是，有报道 称，在癌和瘤中，通常被甲基化的CpG的胞嘧啶被非甲基化。 随着近年来的分子生物学方法的发展，通过检测DNA的有无甲基化来对癌、肿瘤 的早期发现和治疗进行监控逐渐成为可能。例如，在日本特表2000-511776号公报(专利 文献1)、国际公开第02/38801Al号公开文本(专利文献2)和Xiong Z，Laird PW. Nucleic Acids Res. 1997jun 15 ;25(12) :2532-4(非专利文献1)中，公开了为了迅速检测出含CpG 核酸中的甲基化，利用PCR法，诊断癌等的方法。对于这些方法，重点置于特异性地检测出 甲基化DNA方面。 进而，具体来说，公开有由各种体液、组织或细胞系制备核酸试样，利用重亚硫 酸盐等进行将非甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶的修饰，然后，(1)通过能够区分非甲基化 DNA和甲基化DNA的特异性引物用PCR法(Methylation-Specific-PCR :MSP法)进行扩 增，检测出甲基化DNA的方法(专利文献l);以及(2)通过不区分非甲基化DNA和甲基 化DNA的非特异性引物用PCR法进行扩增，用识别该PCR扩增产物内部碱基序列的不同的 限制酶进行处理，从而检测出甲基化DNA的有无和/或比例的方法(Combined Bisulfite RestrictionAnalysis :COBRA法)(非专利文献1)。通过采用这些方法检测出特定的基因 碱基序列中的甲基化DNA的存在，能够对癌J中瘤的早期发现和治疗进行监控。 另外，公开了以高灵敏度检测出甲基化DNA和/或非甲基化DNA的方法(日本特 开2007-74950号公报(专利文献3))。公开了在PCR扩增工序之后，用核酸外切酶处理已 扩增的双链DNA片段，得到单链DNA片段，通过DNA微阵列进行检测的方法。 对于MSP法、C0BRA法，核酸试样(DNA试样)并不是来自组织或细胞系、而是由各种体液而得的试样时，含有DNA量为微量，因此成为对象的DNA不被扩增的情况很多。 —般地说，已知PCR法本身的灵敏度(通过PCR法得到扩增产物的概率)和特异 性(仅扩增目标基因区域的概率)取决于引物的碱基序列和PCR扩增反应的条件。为了提 高PCR的灵敏度，有必要放宽PCR扩增工序的条件，这时PCR的特异性减小。 对于MSP法，使用对非甲基化DNA和甲基化DNA分别具有特异性序列的引物进行 扩增工序。在模板DNA量少时或纯化度差时，例如以各种体液为样本时，必须放宽扩增工序 的条件，而导致特异性减小。因此，不知道检测出的扩增产物是否真的仅由非甲基化DNA或 甲基化DNA扩增而得，成为问题。另外，由于对非甲基化DNA的特异性引物和对甲基化DNA 的特异性引物的序列大为不同(例如，非甲基化DNA用的引物多含A和T，甲基化DNA用的引 物多含C和G)，而导致非甲基化DNA和甲基化DNA的扩增灵敏度、特异性不同。进而，由于 仅以PCR产物的有无来判断有无非甲基化和甲基化，因此无法确认扩增工序自身的错误。 对于COBRA法，对甲基化DNA的灵敏度低成为问题。将各种体液用于样本时，有可 能无法用COBRA法检测出。 专利文献1 :日本特表2000-511776号公报 专利文献2 :国际公开第02/38801A1号公开文本 专利文献3 :日本特开2007-74950号公报 非专利文献l:Xiong Z， Laird PW. Nucleic Acids Res. 1997 junl5 ;25(12): 2532-
技术实现思路
本专利技术的目的在于，提供用于对各种样本高灵敏度地检测出目标基因和/或基因 位点有无非甲基化核酸或甲基化核酸的扩增方法，以及非甲基化和/或甲基化的检测方 法。 本申请专利技术人等鉴于上述课题进行了深入研究，结果专利技术了，通过对能够扩增非 甲基化DNA和甲基化DNA两者的非特异性引物、以及能够扩增非甲基化DNA或甲基化DNA 中的任一者的特异性引物进行设计来进行扩增反应，从而能够正确且高灵敏度地扩增成为 对象的DNA，并且，通过使引物的比例变化，从而以任意比率扩增甲基化和非甲基化核酸，进 行检测的方法。 SP，本专利技术如下构成。 1. —种核酸扩增方法，是来源于生物学试样中可能含有的目标基因和/或基因位 点的含CpG核酸的扩增方法，包含使用引物组来扩增该含CpG核酸的工序，所述引物组至少 含有不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1弓l物、以及区分非甲基化核酸和甲基化核酸 的第2引物，第2引物具有与第1引物实质相同的引物区域。 2.前项1所述的核酸扩增方法，在第1引物的序列中含有至少1个CpG部位，并 且，与该CpG部位的胞嘧啶对应的位置的碱基被混合碱基(Y)和/或混合碱基(R)和/或 肌苷酸(I)取代。 3.前项1或2所述的核酸扩增方法，在第2引物的序列中含有至少2个CpG部位，并且，该CpG部位在甲基化核酸的序列或非甲基化核酸的序列中特异性存在。 4.前项1 3中任一项所述的核酸扩增方法，扩增通过聚合酶链反应(PCR)进行。 5.前项4所述的核酸扩增方法，进一步使用第3引物，所述第3引物是不区分非甲 基化核酸和甲基化核酸的引物，具有与第1引物或第2引物成对地扩增核酸的功能。 6.前项1 5中任一项所述的核酸扩增方法，第1引物和第2引物的浓度比为io : i i : i。 7.前项1 6中任一项所述的核酸扩增方法，在上述扩增工序之前，包含如下工 序使生物学试样与修饰非甲基化胞嘧啶的试剂接触，将能够存在于生物学试样中的核酸 的非甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶，从而对生物学试样进行处理。 8. —种检测生物学试样中可能含有的目标基因和/或基因位点中的甲基化和/或 非甲基化的方法，包含前项1 7中任一项所述的方法。 9.前项8所述的检测方法，包含利用限制酶处理扩增片段，该限制酶识别扩增片 段的序列中除引物区域以外的序列中存在的CG或TG。 10. —种引物组，至少含有不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物，以及区 分非甲基化核酸和甲基化核酸、且具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸扩增方法，其特征在于，是来源于生物学试样中可能含有的目标基因和／或基因位点的含ＣｐＧ核酸的扩增方法，包含使用引物组来扩增该含ＣｐＧ核酸的工序，所述引物组至少含有不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第１引物、以及区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第２引物，第２引物具有与第１引物实质相同的引物区域。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2007-6-8 153086/2007一种核酸扩增方法，其特征在于，是来源于生物学试样中可能含有的目标基因和/或基因位点的含CpG核酸的扩增方法，包含使用引物组来扩增该含CpG核酸的工序，所述引物组至少含有不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第1引物、以及区分非甲基化核酸和甲基化核酸的第2引物，第2引物具有与第1引物实质相同的引物区域。2. 根据权利要求1所述的核酸扩增方法，其中，在第1引物的序列中含有至少1个CpG部位，并且与该CpG部位的胞嘧啶对应的位置的碱基，被混合碱基(Y)和/或混合碱基(R)和/或肌苷酸(I)取代。3. 根据权利要求1或2所述的核酸扩增方法，其中，在第2引物的序列中含有至少2个CpG部位，并且，该CpG部位在甲基化核酸的序列或非甲基化核酸的序列中特异性存在。4. 根据权利要求1 3中任一项所述的核酸扩增方法，其中，扩增是通过聚合酶链反应PCR进行的。5. 根据权利要求4所述的核酸扩增方法，其中，进一步使用第3引物，所述第3引物是不区分非甲基化核酸和甲基化核酸的引物，具有...

【专利技术属性】
技术研发人员：永坂岳司，松原长秀，屉本博美，田中纪章，
申请(专利权)人：拜奥迪克萨姆合同会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]