一种快速检测DNA甲基化的方法技术

本发明专利技术涉及医学生物学检测技术领域，是一种快速检测ＤＮＡ甲基化的方法。针对传统方法的不足做了以下三方面的改进：１．采用添加催化剂ＴＡＣ、盐酸胍加速修饰反应；２．修饰反应过程中多次短时间高温解链，以充分暴露碱基，将未甲基化修饰的胞嘧啶转化为磺化尿嘧啶；３．针对修饰后繁琐的透析脱盐步骤，ＤＮＡ修饰产物纯化时，将修饰后的ＤＮＡ产物结合到玻璃纤维膜或硅藻土或硅胶膜或者其他柱子上进行洗涤脱盐，再用去磺化试剂处理后洗脱，从而得到检测基因的甲基化ＰＣＲ模板，可以直接用于ＰＣＲ扩增，大大节省了脱盐时间。本发明专利技术方法成本低廉、检测时间短、重复性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学生物学检测
，具体是一种快速检测DNA 甲基化的方法。
技术介绍
基因的异常甲基化与肿瘤的发生、发展关系密切，在脊椎动物 中，CpG二核苷酸是DNA甲基化发生的主要位点。CpG常成簇存在，人们 将基因组中富含CpG的一段DNA称为CpG岛(CpGisland) 。 CpG岛常位T 转录调控区附近，DNA甲基化的研究与CpG岛的研究密不可分。甲基化 异常在W期癌、癌前病变，甚至'些良性病变中即已出现，在许多恶 性肿瘤的癌前病变中都发现了多个抑癌基因的启动子区域CpG岛卨甲 基化。据报道，胰腺癌组织中检测出多个与胰腺癌相关的基因发生异 常甲基化，如pl6基因的^常甲基化(Virmani AK， et al. Clin Cancer Res 2001; 7: 584-9 ) 、 MUC2 ( Ho JJ， et al. Int J Oncol 2003; 22: 273-9 )、 NPTX2 (SatoN， etal.CancerRes, 2003， 63: 3735-3742)等，因此 有关DNA甲基化与肿瘤发生的关系口益受到人们的重视，成为肿瘤分 子生物学研究热点之。基因甲基化的研究有很多方法，其中敁常月:I的检测方法是Hennari 节1996年建化的甲基化特计性P(:R(meUivLaUori—specific PCR， MSP)，其基木原理足通过朴:硫酸^钠对DNA样品的修饰，使未甲基化的胞嘧啶发生脱氨基反应，最后在氢氧化钠作用下变为尿嘧啶，而甲 基化的胞嘧啶却不能发生脱氨基反应，碱基不发生转变，这样两者的碱基序列就不一样，然后进行引物特异性的PCR。 MSP中需设计两对引 物，并要求1、引物末端均设讣至检测位点结束；2、两对引物分别 只能与经亚硫酸氢钠处理后的序列互补配对，其中一对结合处理后的 甲基化DNA链，另一对结合处理后的未甲基化DNA链。通过凝胶电 泳或DNA测序进一步分析PCR产物，如果使用针对处理后的甲基化 DNA链的引物能扩增出片段，说明该被检测的位点存在甲基化；如 果使用针对处理后的未甲基化DNA链的引物能扩增出片段，说明被 检测的位点不存在甲基化。MSP法包括如下步骤.-1、 制备待测DNA:按常规方法取组织匀浆，用酚氯仿法(详见F.M.奥斯伯等，精编 分子生物学实验指南，北京科学出版社，2005: 46)或基因组DNA 抽提试剂盒提取DNA。2、 DNA亚硫酸氢钠修饰将DNA变性，成为单链DNA，使碱基充分暴露；加入终浓度为 lmol—6mo1的亚硫酸氢钠，使DNA单链上未甲基化的胞嘧啶与亚硫 酸氢钠进行修饰反应生成磺化胞嘧啶，磺化胞嘧啶在水的作用下脱氨 基生成磺化尿嘧啶;而5'-甲基化胞嘧啶不能被修饰;将修饰后的DNA 产物经过透析脱盐，用氢氧化钠脱磺化，使得磺化尿嘧啶变为尿嘧啶。DNA经修饰后，未甲基化的胞嘧啶碱基变为尿嘧啶，而甲基化的胞 嘧啶则不变。3、 纯化将经修饰后的DNA用乙醇沉淀、洗涤，再溶解后作PCR模板。4、 PCR扩增和检测分析由于待测基因的正常核苷酸序列、胞嘧啶的数量和所在位点是明 确的，因此可设计相应的正、反向甲基化特异性引物和未甲基化特异 性引物，以修饰后的DNA为模板，进行PCR扩增，甲基化特异性的引 物只能扩增甲基化的序列，未甲基化特异性引物只能扩增未甲基化的 序列；最后将PCR产物通过凝胶电泳或DNA测序分析，就可确定所测组 织中该基因中CpG岛的胞嘧啶甲基化程度。具体步骤主要为1、 制备待测DNA:按常规方法如酚氯仿法从组织中抽提DNA。2、 DNA亚硫酸氢钠修饰1) 、取1吗DNA，溶于20nl水中，95。C水浴10分钟，立即放于 冰浴；加入2nllOM氢氧化钠，使DNA变性，成为单链DNA;2) 、加入亚硫酸氢钠修饰液230ul (3M亚硫酸氢钠，10mM氢 醌，PH5.0);置于55"C避光修饰16小时，DNA被修饰，未甲基化 的胞嘧啶被修饰为磺化尿嘧啶。3、 DNA修饰产物的纯化1)、将上述DNA修饰产物在4X:下用双蒸水透析过夜，去除多余的亚硫酸氢钠；2) 、脱磺化加入10MNaOH使其终浓度为0.3M，室温20分钟; 再加入等当量的1M盐酸中和NaOH，磺化尿嘧啶脱磺化后成尿嘧啶；3) 、沉淀加入四分之一体积的10M醋酸铵和2倍体积乙醇，将 DNA修饰产物置于-2(TC沉淀过夜；4) 、洗涤13000rpm离心10分钟，弃上清，用70%酒精洗涤2 次；干燥IO分钟，加入20plTE使其溶解，得纯化的DNA修饰产物， 亦即PCR模板。4、 PCR扩增和检测分析用设计的待测基因的正、反向甲基化特异性引物和未甲基化特异性引物进行PCR扩增。PCR反应体系如下10x PCR buffer (without MgCb)2.5plMgCl2 (25mM)2nldNTP(2-5mM)2pl正向引物(20jiM)0.5^1反向引物(20pM)0.5^1H20模板IWTaq酶(5u4d)0.5nl总体积25jd反应条件如下94匸3分钟 9420秒*58"C 20秒35循环 72°C 15秒 72°C 5分钟检测分析将PCR扩增产物与标准品进行凝胶电泳检测或DNA测 序分析，就可确定该基因的胞嘧啶甲基化程度。如果其中多数基因发 生异常甲基化，则就提示该患者可能得相应的癌症。这种传统的检测方法存在如下缺点1、操作繁琐，特别是在亚 硫酸氢钠修饰过程中，修饰反应慢，时间长，通常需要16—18小时； 2、 DNA变性成为单链后，单链上的碱基还会互相配对，有可能使 碱基暴露不充分，从而导致亚硫酸氢钠修饰不完全，实验重复性不高， 影响结果的可靠性；3、亚硫酸氢钠修饰后，透析脱盐时间也很长， 工作量大，因此制约了 MS-PCR的研究。但若采用Zymo公司生产的 DNA甲基化检测试剂盒(EZDNAMethylation-Gold Kit)，虽然操 作方便，检测时间短，但价格昂贵，且每次得到的PCR模板只能用 于2个基因的甲基化检测，限制了多基因检测的进行，不能满足多数 实验的需要。
技术实现思路
本专利技术提供一种成本低廉、检测时间短、重复性好的DNA甲基 化的检测方法。本专利技术的操作步骤也主要包括制备待测DNA、 DNA亚硫酸氢 钠修饰、纯化以及PCR扩增和检测分析等四步，但本专利技术针对传统 方法的不足做了以下三方面的改进1、 针对亚硫酸氢钠DNA修饰时间长的不足，采用添加催化剂 TAC和盐酸胍加速修饰反应，使DNA在催化剂的作用下加快与亚硫 酸氢钠反应；2、 修饰反应中采用多次短时间高温解链，以充分暴露DNA的 碱基，使未甲基化的胞嘧啶转化为磺化尿嘧啶，从而提高实验的重复 性；，3、针对修饰后DNA纯化时繁琐的透析脱盐步骤，采用纯化柱 进行纯化，先将修饰后的DNA产物吸附于玻璃纤维膜或硅藻土或硅 胶膜制成的纯化柱il，再依次进行洗涤脱盐、去磺化处理、洗涤和 DNA洗脱，从而得到纯化的检测DNA基因甲基化的PCR模板，可 以直接用于PCR扩增，大大节省了脱盐时间。具体步骤主要为1、 制备待测DNA:按常规方法。2、 DNA亚硫酸氢钠修饰1) 、取ljigDNA，溶于20nl水中，95"C水浴10分钟；立即放于 冰浴；加入2nllOM氢氧化钠本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测ＤＮＡ甲基化的方法，包括如下步骤：制备待测ＤＮＡ、ＤＮＡ的亚硫酸氢钠修饰、ＤＮＡ修饰产物的纯化以及ＰＣＲ扩增和检测，其特征在于亚硫酸氢钠修饰液中添加了催化剂ＴＡＣ和盐酸胍，以加速ＤＮＡ的亚硫酸氢钠修饰反应。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：卫立辛，张春东，蒋国成，徐赟，张黎，吴孟超，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]