ZNF545基因甲基化定量检测方法技术

本发明专利技术公开了一种ZNF545基因甲基化的定量检测方法，将第一荧光标记物引入到上游引物或下游引物中，将第二荧光标记物引入到dCTP底物中，在PCR扩增过程中同时将两种荧光标记物标记到待测样品中ZNF545基因序列中，在建立荧光强度标准化曲线后，可根据两种荧光标记物的信号强度比值来定量检测待测样品中ZNF545基因的甲基化程度。本发明专利技术的甲基化定量检测的方法不受甲基化位点的影响，快速，准确的对基因甲基化进行定量；灵敏度较高，只需要微量的DNA样品就可进行检测；无需设计特异性探针或特异性引物，方法简便易行，所采用的技术简单易于实现，成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA甲基化检测，主要涉及ー种定量检测DNA甲基化的方法。
技术介绍
癌症的早期诊断对癌症患者的有效治疗至关重要。目前对癌症的诊断主要依据临床症状、直接触诊、图像信号检测和组织病理学检查等，但绝大多数癌症临床症状出现较晚，且活体取样困难，在首次诊断时已呈晚期，严重影响了患者的治疗和病人的愈后。因此寻找恶性肿瘤的生物标志物，应用于早期诊断和筛查，对肿瘤患者的治疗和预后具有重要的意义。DNA甲基化程度和模式的改变是肿瘤发生的ー个重要因素。这些变化包括CpG岛局部的高甲基化和基因组DNA低甲基化状态。在正常细胞中，位于抑癌基因启动子区域的CpG岛处于低水平或未甲基化状态，此时抑癌基因处于正常的开放状态，抑癌基因不断表达抑制肿瘤的发生。而在肿瘤细胞中，该区域的CpG岛被高度甲基化，染色质构象发生改变，抑癌基因的表达被关闭，从而导致细胞进入细胞周期，凋亡丧失，DNA修复缺陷，血管生成以及细胞粘附功能缺失等，最终导致肿瘤发生。同样，对于在正常细胞中处于高度甲基化的一些基因和重复序列，如果其甲基化程度降低，这些基因将表达和重复序列将激活，从而导致基因印记丢失，细胞过度增长，不合适的细胞特异性表达，基因组脆性増加，以及内寄生序列(endoparasitic sequence)激活,最终也导致肿瘤发生。由于CpG岛的局部高度甲基化要早于细胞恶性增生，故其甲基化的检测可用于肿瘤的预测，而全基因组水平的低水平甲基化状态，则随着肿瘤恶性程度的增加而进ー步降低，使其可用于肿瘤的诊断以及分级。近年来，不断有研究显示人类肿瘤的发生、发展与DNA甲基化的异常有关，而且早在肿瘤临床确诊之前就可检测出特异基因的甲基化异常现象。所以甲基化可以作为肿瘤等早期诊断的生物标记物和预后评估指标，对肿瘤的筛查和风险评估、早期诊断、分期分型 、预后判断及治疗监测都具有重要的意义。ZNF545基因为含KRAB的锌指基因，其编码的蛋白能够与DNA结合，ZNF545基因为转录调控因子，研究证明ZNF545为一种抑癌基因(The KRAB-containing zinc fingerprotein ZNF545 is a functional tumor suppressor exerting proapoptotic andantiproliferation abilities with frequent epigenetic inactivation in multiplecarcinomas， ChengYingduan， LiangPei and GengHua，101st Annual Meeting of theAmericanAssociationforCancerResearch, 2010)，在胃癌细胞中抑制核糖体 RNA 转录(Zinc-finger protein 545 is a novel tumour suppressor that acts Dy mhioitmgribosomal RNA transcription in gastric cancer，Wang S，Cheng Y and Du W, Gut，2012)，ZNF545基因作为抑癌基因，其甲基化程度与肿瘤的发生密切相关。ZNF545基因序列中CpG含量丰富，如何对其进行甲基化定量检测成为ー个亟待解决的问题。针对特定基因的甲基化分析现有技术中主要有以下几种方法，第一种现有技术是甲基化敏感性限制性内切酶 _P C R/Southern(methyIation-sensitive restrictionEndonucIease-PCR/Southern, MSRE-PCR/Southern),这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后，进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaI1-Msp I (CCGG)和 Sma-Xmal (CCCGGG)等。第二种现有技术是重亚硫酸盐测序法，该方法首先用重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需片段，则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是精确度很高，能明确目的片段中每ー个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序，过程较为繁琐、昂贵。第三种现有技术是，甲基化特异性的PCR(methylation-specificPCR,MS_PCR),该方法中DNA先用重亚硫酸盐处理，随后行引物特异性的PCR。其设计两对引物，分别与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即ー对结合处理后的甲基化DNA链，另ー对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MS-PCR扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；反之亦然。该方法适合判断特点位点的甲基化情况。第四种现有技术为甲基化荧光法，结合重亚硫酸盐处理待测DNA片段，设计ー个能与待测位点区互补的探针， 探针的5’端连接报告荧光，3’端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸吋，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列上5'端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及程度。该方法适合分析特定位点甲基化情況。第五种现有技术是焦磷酸测序，该方法由4种酶催化同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每ー轮测序反 应中，只加入ー种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就能将其加入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值,其高度与核苷酸数目成正比。当用于甲基化检测时，经重亚硫酸盐处理的序列可以看作是C-T型的SNP改变。第六种现有技术为结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法，这种方法对标本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA的甲基化状况。以上各项现有技术在特定基因区域DNA甲基化的准确、高效的定量方面仍缺乏好的解决方法。由于ZNF545基因GpC含量较高，而CpG位点发生甲基化具有随机性，尤其在肿瘤发生早期甲基化程度很低的情况下，针对具体甲基化位点设计特异性引物或探针的方法具有很大局限性，不能准确地反应整个ZNF基因中CpG位点聚集区的甲基化情況。此外，肿瘤发展阶段主要是与甲基化高发区的甲基化程度有关，而与具体哪个CpG位点无关。因此需要解决现有定量甲基化分析方法受随机甲基化影响的问题，提出ー种新的简便、可靠、快速的获取与肿瘤发展直接有关的定量甲基化程度分析方法
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种定量检测DNA甲基化的方法，可简便、可靠、快速的获取与肿瘤发展直接有关的甲基化程度分析。本专利技术提供的ー种ZNF基因甲基化定量检测的方法，包括以下步骤步骤一、建立ZNF545基因荧光强度的标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ZNF545基因甲基化定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、建立ZNF545基因甲基化的标准化曲线：对ZNF545基因分别建立甲基化程度为100％的阳性质控品与甲基化程度为0％的阴性质控品，将阳性与阴性质控品按照质量比为0∶1、1∶3、1∶1、3∶1、1∶0混合，得到一组标准品，标准品的甲基化程度分别为0％、25％、50％、75％、100％；用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二荧光标记物标记dCTP；以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的引物对标准品进行PCR扩增，检测所述标准品PCR扩增的产物中的第一荧光标记物和第二荧光标记物的荧光强度；其中，第一荧光标记物的荧光强度为M，第二荧光标记物的荧光强度为N；以N/M为纵坐标，标准品的甲基化程度为横坐标，得到ZNF545基因甲基化的标准曲线方程；步骤二：待测样品ZNF545基因甲基化定量检测：抽提待测样本的血液基因组DNA，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理；用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二荧光标记物标记dCTP，以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的引物对亚硫酸氢盐处理后的待测样本基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增后的产物中的第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度，第一荧光标记物的信号强度为M1，第二荧光标记物的信号强度为N1；步骤三、将N1/M1代入步骤一的标准曲线方程，计算得出对应横坐标的值，即为待测样本中ZNF545基因甲基化程度。...

【技术特征摘要】
1.一种ZNF545基因甲基化定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一、建立ZNF545基因甲基化的标准化曲线 对ZNF545基因分别建立甲基化程度为IOO %的阳性质控品与甲基化程度为O %的阴性质控品，将阳性与阴性质控品按照质量比为O : 1、1 3、1 1、3 1、1 O混合，得到一组标准品，标准品的甲基化程度分别为0%、25%、50%、75%、100% ； 用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二荧光标记物标记dCTP ； 以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的引物对标准品进行PCR扩增，检测所述标准品PCR扩增的产物中的第一荧光标记物和第二突光标记物的突光强度； 其中，第一突光标记物的突光强度为M,第二突光标记物的突光强度为N ； 以N/M为纵坐标，标准品的甲基化程度为横坐标，得到ZNF545基因甲基化的标准曲线方程； 步骤二 待测样品ZNF545基因甲基化定量检测 抽提待测样本的血液基因组DNA，对基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化处理； 用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物或下游引物，用第二荧光标记物标记dCTP，以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的引物对亚硫酸氢盐处理后的待测样本基因组DNA进行PCR扩增，检测PCR扩增后的产物中的第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度，第一荧光标记物的信号强度为M1，第二荧光标记物的信号强度为NI ； 步骤三、将N1/M1代入步骤一的标准曲线方程，计算得出对应横坐标的值，即为待测样本中ZNF545基因甲基化程度。2.—种ZNF545基因甲基化定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤一、建立ZNF545基因甲基化的标准化曲线 对ZNF545基因分别建立甲基化程度为100%的阳性质控品与甲基化程度为0%的阴性质控品，将阳性与阴性质控品按照质量比为O : 1、1 3、1 1、3 1、1 O混合，得到一组标准品，标准品的甲基化程度分别为0%、25%、50%、75%、100% ； 用第一荧光标记物标记ZNF545基因的上游引物，用第三标记物标记下游引物或用第一荧光标记物标记ZNF545基因的下游引物，用第三标记物标记上游引物；用第三标记物标记用第二荧光标记物标记dCTP ； 以dTTP、dGTP、dATP和标记有第二荧光标记物的dCTP作为底物，以标记有第一荧光标记物的上游引物引物和标记有第三标记物的下游引物或用标记有第一荧光标记物的下游引物引物和标记有第三标记物的上游引物对标准品进行PCR扩增，所述的第三标记物为亲和标记物；将PCR扩增产物加入到固定有亲和素受体的酶标板中，使PCR扩增产物通过第三标记物与亲和素受体的作用固定到酶标板上，用酶标仪测量第一荧光标记物和第二荧光标记物的信号强度； 其中，第一突光标记物的突光强度为M,第二突光标记物的突光强度为N, 以N/M为纵坐标，标准品中的甲基化程度为横坐标，得到ZNF545基因甲基化的标准曲...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡林涛，王朝晖，龚萍，苏献伟，石碧华，
申请(专利权)人：深圳先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：