Foxp3基因 TSDR位点甲基化检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法。该方法依次包括下述步骤：（1）从全血中提取基因组DNA；（2）DNA的亚硫酸氢盐处理；（3）MS-HRMPCR；（4）经HRM-PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。该方法相对于现有的MS-HRM方法，更加简单易行，有望成为评估Foxp3基因TSDR位点甲基化的精确、廉价、快速的工具，并为临床指导评价SLE活动性、疗效和预后提供帮助。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基因位点甲基化检测方法。
技术介绍
SLE是一种由于自身免疫反应引起的慢性炎性疾病，以多个器官、组织受累和血清中有多种自身抗体为特征，但其发病机制尚未明了，大量资料证明是在遗传、环境、感染和性激素等因素的影响下出现的细胞免疫功能失调所致。SLE患者临床异质性大，病情迁延，反复波动。因此，在诊断SLE时，应进行包括其活动性与严重程度的病情判断，以利于选择治疗方案。但是对于SLE活动度的判定并非易事，活动性与重症度并非是平行关系，且SLE是多脏器受害的疾病，受侵犯脏器损害不同，对疾病活动性的评价也会发生变化。包括对感染性疾病在内的其他疾病进行鉴别，进一步加大了活动性判定的难度。现行的SLE活动性判定依据主要有:SLE病情活动指数(systemic lupuserythematosus disease activity index, SLEDAI)、狼疮活动测量标准(systemic lupusactivity measure, SLAM)、欧洲统一狼疮损伤指数(European consensus lupus damageindex，ECLAM)和大不列颠群岛狼疮评估组指数(British Isles lupus assessmentgroup, BILAG)，其中SLEDAI和BILAG是目前狼疮随机临床试验最常用的两个评估工具。但上述各种评分方法仍不完美，各有优缺点。单独使用，有时并不能对活动性给出准确的评判。因此，需要一种更为有效、更为精准判定方法。CD4+ CD25+调节性T细胞(Treg)首次由日本学者Sakaguchi等于1995年所报道，这类T细胞介导的免疫调节作用是维持自身免疫耐受的关键，此发现引起了免疫学界的广泛关注。Treg的免疫抑制性是指经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD4+ CD25-T细胞的活化和增殖。大量研究表明，Treg不仅在自身耐受的获得和维持及自身免疫的防御中起重要作用，在肿瘤、移植耐受甚至是病原体感染等免疫反应调节中也扮演重要角色。虽然其机制至今还不是十分明确，但大量研究表明Treg细胞的发育、功能的发挥与一个蛋白质分子——Foxp3有着密切的联系。Foxp3是一种转录因子，它能通过调控特定基因的表达，从而控制Treg细胞的分化成熟。有研究发现与非活动性SLE患者和健康对照组相比,活动性SLE患者外周血⑶4+T细胞表面⑶69表达增多，而⑶25的表达明显减少，这一现象提示，活动性SLE患者中T细胞被大量激活，却没有诱导出免疫调节性Treg细胞。进一步研究显示SLE患者外周血Foxp3的表达也明显低于对照组，它的表达水平与⑶4+⑶25+调节性T细胞数量存在依赖关系。Treg细胞在发挥抑制作用机制中起着重要作用。因此，活动性SLE患者体内缺乏CD4+CD25+ T细胞可能会导致机体抑制自身免疫反应的功能减弱，并与SLE的发生发展密切相关。目前，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-High Resolution Melting CurveAnalyse，简称MS-HRM)是一种不需要PCR产物后续操作的，简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。该方法在甲基化修饰位点附近设计实时定量PCR引物，对来自经重亚硫酸盐修饰的DNA的相关区进行特异性PCR扩增。重亚硫酸盐修饰DNA，让非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5 -甲基胞嘧啶保持不变，随后使用含饱和DNA结合染料的PCR体系扩增，扩增后通过比较曲线的熔解温度和峰形进行分析。MS-HRM因其高敏感性，可以区分扩增产物中少至I个碱基变化的序列差异，从而通过尿嘧啶/胞嘧啶的差异判断扩增子来源的初始模板的甲基化修饰差异。但MS-HRM的数据一直没有一种公认的分析方法，目前结果分析大多采用标准曲线法，将甲基化和非甲基化对照DNA (经过重亚硫酸盐修饰)以不同比例混合，创建一系列甲基化梯度标准品。结合标准品的特征熔解曲线和温度，用专门软件进行计算分析，从而得出样本中的DNA甲基化比率。这种方法使得实验更加繁琐，增加了实验环节，在标准品在配置的过程中极易因操作原因，导致标准品配比不准确，使得实验准确性和重复性大打折扣。且加大了实验成本，延长了实验时间。因此限制了 MS-HRM技术在临床诊断的推广应用。
技术实现思路
，本专利技术的目的在于基于并改进现有MS-HRM方法，提供一种更为简单的检测Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法。本专利技术提供的检测 Foxp3基因TSDR位点甲基化水平的方法依次包括下述步骤:(I)从样本全血中提取基因组DNA ;(2) DNA的亚硫酸氢盐处理；(3) MS-HRM PCR =MS-HRMPCR反应中，Foxp3基因TSDR位点的特异性扩增引物序列为:F:5/ -TTGGGGGTAGAGGAGGATTTAGAGGGTC-3/，R:5/ -CAACACCCATATCACCCCACCTAAA-3'；(4)经HRM-PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。本专利技术改进了传统用于检测基因甲基化水平的MS-HRM方法，基于MS-HRM的高灵敏性，直接使用MS-HRM检测系统性红斑狼疮外周血基因组DNA中Foxp3基因TSDR的Tm值，以此为指标，反应活动性SLE患者Foxp3基因TSDR甲基化水平。因为直接使用Tm值进行统计学分析，不用标准曲线进行后续的甲基化百分比计算。这样我们省去了标准品制备和软件分析环节，大大节省了时间和成本，简化了实验步骤，使得实验操作更简单且减少了实验误差。特别是无需甲基化计算软件分析，使得很多没有配备甲基化分析软件的HRM实时定量PCR仪均能开展此实验。该方法相对于现有的MS-HRM方法，更加简单易行，有望成为评估Foxp3基因TSDR甲基化的精确、廉价、快速的工具，并为临床指导评价SLE活动性、疗效和预后提供帮助。TSDR (Treg-specific demethylated region)是 Foxp3 基因中的一个高度保守的位点，其在自然Treg细胞中完全去甲基化，但在效应T细胞中是甲基化的。Foxp3基因TSDR的甲基化使得相关转录因子不能结合至其启动子区，导致Foxp3低表达。本专利技术研究得到:以慢性感染性疾病作为疾病对照，与非活动性SLE患者，慢性感染性疾病患者以及正常人群相比，活动性SLE患者。Foxp3的TSDR区甲基化水平明显升高，且与SLE活动性呈高度正相关。因此，通过检测Foxp3基因TSDR的甲基化水平，对评价SLE病人的活动性提供帮助。附图说明图1:各组样本MS-HRM PCR检测Tm值示意图，其中HC:健康对照；CM1:慢性感染性疾病；In SLE::非活动性SLE ；Ac SLE:活动性SLE ； 图2: SLEDAI分值与Tm值间相关性 图3 =MS-HRM PCR反应条件； 图4 =HRM-PCR原理和特点。具体实施例方式实施例1: Foxp3基因TSDR位点甲基化检测 1、从300ul全血中提取基因组DNA (1)裂解1:取300ul全 血放入到1.5ml的离心管中，加入900ul裂解液I。上下颠倒混匀，涡旋混匀15秒后放入离心机中离心，离心速率为800本文档来自技高网...

【技术保护点】
Foxp3?基因TSDR位点甲基化检测方法，其特征在于依次包括下述步骤：（1）从样本全血中提取基因组DNA；（2）DNA亚硫酸氢盐处理；（3）MS?HRM?PCR；（4）经HRM?PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。

【技术特征摘要】
1.Foxp3基因TSDR位点甲基化检测方法，其特征在于依次包括下述步骤: Cl)从样本全血中提取基因组DNA ； (2)DNA亚硫酸氢盐处理；(3)MS-HRM PCR ； (4)经HRM-PCR检测，读取样本Tm值，根据样本Tm值判断Foxp3基因TSDR甲基化水平。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于:步骤(3)MS-HRM PCR反应时...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆前进，N·欧文，梁功平，赵明，余鑫海，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：