基因甲基化检测方法和检测试剂盒及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基因甲基化检测方法和检测试剂盒及其应用，本发明专利技术首次使用同一基因的两条链，即正、反义链甲基化荧光累积方法提高基因甲基化检测灵敏度，与现有的甲基化检测技术相比，本发明专利技术中的利用双链检测基因甲基化程度的方法具有较高的基因甲基化检测灵敏度的优点，本发明专利技术方法充分利用DNA的两条链，增加荧光信号值，使甲基化荧光双重累积，提高基因甲基化的检测灵敏度，采用定性法即可区分甲基化程度高低；除此之外，检测过程为闭管同孔反应，即在一个孔中可同时检测到两条链的甲基化情况，操作简单快速，减少污染的可能性；安全，整个体系不包含有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。

Gene methylation detection method and detection reagent kit and application thereof

The invention discloses a gene methylation detection method and detection kit and its application, the invention is used for the first time the two strands of the same gene, that is, antisense strand methylation fluorescence accumulation method to improve gene methylation detection sensitivity, compared with methylation detection technology at present, the advantages of the detection sensitivity of the gene methylation the method uses double stranded gene methylation level is higher, the two chains the method makes full use of DNA, increase the fluorescence signal values, the methylation of fluorescence double accumulation, improve the detection sensitivity of DNA methylation, can distinguish the methylation level using qualitative method; in addition, detection process for the closed tube with holes, which can simultaneously detect the methylation status of two strands in a hole, the operation is simple and quick, the possibility of reducing pollution; safety, The whole system does not contain toxic and harmful substances, no need to open the PCR product, no harm to the test personnel and the environment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物领域，特别涉及基因的甲基化检测。
技术介绍
本专利技术涉及基因检测领域，特别是涉及一种能够提高基因甲基化检测灵敏度的方法及其试剂盒。DNA甲基化与肿瘤的发生发展密切相关，它是肿瘤发生的一个早期事件，由于CPG岛的高度甲基化早于肿瘤增生，故检测某些DNA位点的甲基化可以作为肿瘤标志物，是肿瘤早期辅助诊断、患病预测及疗效评估的一个潜在指标。DNA甲基化分析通常需要对DNA进行高温硫化转化修饰。高温硫化转化后，双链DNA会解离成两条不互补的单链。目前在现有的甲基化检测技术中还没有同时检测同一基因两条单链的甲基化总体水平的先例，现有的基因甲基化检测技术都是针对一条单链进行PCR反应，从而检测基因甲基化情况。在某类肿瘤检测中，DNA甲基化的程度不是很明显，单链检测基因甲基化的灵敏度较低，必须采用定量法才可确定基因甲基化的程度，进而区分癌与非癌。定量法分析较为麻烦复杂，远不如定性法分析简单。单链检测基因甲基化没有充分考虑基因两条链甲基化的总体水平。例如申请号为201610264899.7《一种人体外周血游离DNA中septin9基因甲基化检测试剂盒及检测方法》。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术其中一个目的在于提高基因甲基化检测灵敏度，能够充分检测基因两条链的甲基化总水平。以内参基因为标准衡量本专利技术方法的准确性和有效性。本专利技术提供了一种基因甲基化检测方法，该方法首先针对目的基因设计目的基因甲基化正义链的引物对和目的基因甲基化反义链的引物对，以及设计检测目的基因甲基化的正、反义链的两条探针，目的基因甲基化正义链的引物对为目的基因甲基化正义链的正向引物和目的基因甲基化正义链的反向引物，目的基因甲基化反义链的引物对为目的基因甲基化反义链的正向引物和目的基因甲基化反义链的反向引物，目的基因甲基化的正、反义链的两条探针分别为目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针。由于该方法考虑基因两条链甲基化的情况设计相关引物和探针，使用设计的引物和探针可以检测目的基因甲基化的整体水平。以内参基因为标准衡量本专利技术方法的准确性和有效性。根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，目的基因为septin9基因，所述septin9甲基化位点为启动子区的CpG岛，序列为转录起始位点上游的-670～-555bp区；根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，目的基因septin9甲基化正义链的正向引物序列如SEQNo.1：5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’目的基因septin9甲基化正义链的反向引物序列如SEQNo.2：5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’目的基因septin9甲基化反义链的正向引物序列如SEQNo.3：5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’目的基因septin9甲基化反义链的反向引物序列如SEQNo.4：5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’；根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，目的基因septin9甲基化正义链探针序列如SEQNo.5：5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’目的基因septin9甲基化反义链探针序列如SEQNo.6：5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，目的基因septin9甲基化正义链探针、目的基因septin9甲基化反义链探针5'端报告荧光基团为FAM，目的基因septin9甲基化正义链探针、目的基因septin9甲基化反义链探针3'端的猝灭基团为BHQ1。根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，使用内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针，内参基因为ACTB，内参基因引物序列如SEQNo.7：ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，内参基因引物序列如SEQNo.8：ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，内参基因甲基化探针序列如SEQNo.9：ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，方法步骤为：A、从待测样本中提取DNA，B、对提取的DNA进行硫化转化修饰，C、对修饰后的DNA进行纯化，得到样本模板，D、将所述目的基因甲基化正义链的正向引物、目的基因甲基化正义链的反向引物、目的基因甲基化反义链的正向引物序、所述目的基因甲基化反义链的反向引物、目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针、内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针以及所述样本模板同时加到同一孔中进行PCR扩增反应，E、计算目的基因正、反义双链荧光累积法中septin9基因CP值；以内参基因为标准衡量本专利技术方法的准确性和有效性。根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mMdNTPs、0.1～1uM目的基因甲基化正义链的引物对、0.1～1uM目的基因甲基化反义链的引物对、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM目的基因甲基化正义链探针、0.1～1uM目的基因甲基化反义链探针、0.01～0.10U/ulTaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁，0.1～1uM内参基因甲基化引物对，0.1～1uM内参基因甲基化探针。根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测方法，目的基因为HOXA9基因，目的基因HOXA9甲基化正义链的正向引物序列如SEQNo.10：5’-TTATTGTTTTGTTGGACGGGTACG-3’目的基因HOXA9甲基化正义链的反向引物序列如SEQNo.11：5’-AATTTCATATAACAACTTAATAACACCG-3’目的基因HOXA9甲基化反义链的正向引物序列如SEQNo.12：5’-CGTTCGCGTTTTTATTGGTC-3’目的基因HOXA9甲基化反义链的反向引物序列如SEQNo.13：5’-CGAACCATTAATAACGTACGAA-3’目的基因HOXA9甲基化正义链探针序列如SEQNo.14：5’-AAATTACCGACGCCCGCG-3’目的基因HOXA9甲基化反义链探针序列如SEQNo.15：5’-AAACGAACACGTAACGCG-3’；根据本专利技术的一方面，还提供了一种直肠癌检测方法，使用上述的基因甲基化检测方法检测目的基因甲基化程度判断是否患有直肠癌；根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测试剂盒，包含目的基因甲基化正义链的正向引物、目的基因甲基化正义链的反向引物、目的基因甲基化反义链的正向引物、目的基因甲基化反义链的反向引物、目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针；根据本专利技术的一方面，还提供了一种基因甲基化检测试剂盒，目的基因甲基化正义链的正向引物序列如SEQNo.1：5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’，所述目的基因甲基化正义链的反向引物序列如SEQNo.2：5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’，所述目的基因甲基化反义链的正向引物序列如S本文档来自技高网...

【技术保护点】
基因甲基化检测方法，其特征在于：针对目的基因设计目的基因甲基化正义链的引物对和目的基因甲基化反义链的引物对，以及设计检测目的基因甲基化的正、反义链的两条探针，所述目的基因甲基化正义链的引物对为目的基因甲基化正义链的正向引物和目的基因甲基化正义链的反向引物，所述目的基因甲基化反义链的引物对为目的基因甲基化反义链的正向引物和目的基因甲基化反义链的反向引物，所述目的基因甲基化的正、反义链的两条探针分别为目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针。

【技术特征摘要】
1.基因甲基化检测方法，其特征在于：针对目的基因设计目的基因甲基化正义链的引物对和目的基因甲基化反义链的引物对，以及设计检测目的基因甲基化的正、反义链的两条探针，所述目的基因甲基化正义链的引物对为目的基因甲基化正义链的正向引物和目的基因甲基化正义链的反向引物，所述目的基因甲基化反义链的引物对为目的基因甲基化反义链的正向引物和目的基因甲基化反义链的反向引物，所述目的基因甲基化的正、反义链的两条探针分别为目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针。2.根据权利要求1所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，所述的目的基因为septin9基因，所述septin9甲基化位点为启动子区的CpG岛，序列为转录起始位点上游的-670～-555bp区。3.根据权利要求2所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，所述目的基因甲基化正义链的正向引物序列如SEQNo.1：5’-TCGTTGTTTATTAGTTATTATG-3’所述目的基因甲基化正义链的反向引物序列如SEQNo.2：5’-TCCGAAATAATCCCATCCCAT-3’所述目的基因甲基化反义链的正向引物序列如SEQNo.3：5’-TTCGAAATGATTTTATTTAGTTG-3’所述目的基因甲基化反义链的反向引物序列如SEQNo.4：5’-CGCTACCCACCAACCATC-3’。4.根据权利要求3所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，所述目的基因甲基化正义链探针序列如SEQNo.5：5’-TAACCGCGAAATCCGACATA-3’所述目的基因甲基化反义链探针序列如SEQNo.6：5’-TATACCGAACCCCGCGATCA-3’。5.根据权利要求4所述的基因甲基化检测方法，所述目的基因甲基化正义链探针、目的基因甲基化反义链探针5'端报告荧光基团为FAM，所述目的基因甲基化正义链探针、目的基因甲基化反义链探针3'端的猝灭基团为BHQ1。6.根据权利要求5所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，使用内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针，所述内参基因为ACTB，所述内参基因引物序列如SEQNo.7：ACTB-F:5’-GAATTTGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGT-3’，所述内参基因引物序列如SEQNo.8：ACTB-R:5’-CCTACTCCTCCCTTAAAAATTACAA-3’，所述内参基因甲基化探针序列如SEQNo.9：ACTB-probe:5’-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3’。7.根据权利要求6所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，所述方法步骤为：A、从待测样本中提取DNA，B、对提取的DNA进行硫化转化修饰，C、对修饰后的DNA进行纯化，得到样本模板，D、将所述目的基因甲基化正义链的正向引物、目的基因甲基化正义链的反向引物、目的基因甲基化反义链的正向引物、目的基因甲基化反义链的反向引物、目的基因甲基化正义链探针和目的基因甲基化反义链探针、内参基因甲基化的引物对和内参基因甲基化探针以及所述样本模板同时加到同一孔中进行PCR扩增反应。E、计算目的基因正、反义双链荧光累积法中septin9基因CP值。8.根据权利要求7所述的基因甲基化检测方法，所述PCR扩增反应体系的终浓度组成为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mMdNTPs、0.1～1uM目的基因甲基化正义链的引物对、0.1～1uM目的基因甲基化反义链的引物对、0.05～2ng/ul模板DNA、0.1～1uM目的基因甲基化正义链探针、0.1～1uM目的基因甲基化反义链探针、0.01～0.10U/ulTaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁，0.1～1uM内参基因甲基化引物对，0.1～1uM内参基因甲基化探针。9.根据权利要求1所述的基因甲基化检测方法，其特征在于，所述目的基因为HOXA9基因，所述目的基因甲基化正义链的正向引物序列如SEQNo.10：5’-T...

【专利技术属性】
技术研发人员：王弢，高兵，李虹侠，
申请(专利权)人：江苏为真生物医药技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32