一种甲基转移酶活性实时测定方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种甲基转移酶活性实时测定方法及试剂盒。包括在一个反应体系内两个同时进行的反应：(1)在保证以S‑腺苷蛋氨酸为甲基供体的甲基转移酶有生物学活性的缓冲体系中，加入含有甲基转移酶(MT)的样品、甲基供体和相应的底物或者直接在含有甲基转移酶的液态样品中加入S‑腺苷蛋氨酸甲基供体和相应的底物进行反应以便产生S‑腺苷同型半胱氨酸(SAH)产物，底物为甲基的受体物质；(2)利用免疫学方法检测SAH的含量，来确定反应体系中甲基转移酶的活性。本发明专利技术把MT催化的生化反应与测定产物SAH的免疫反应同时进行，把这两个过程有机地结合起来，对于准确地测定分子性状极其不稳定的SAH尤其具有重大的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及甲基转移酶检测
，具体涉及一类以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体的甲基转移酶生物学活性实时测定方法及检测试剂盒。
技术介绍
甲基转移酶(Methyltransferase,MT)是一类催化甲基化反应的酶，一般以S-腺苷蛋氨酸(S-Adenosyl Methionine,SAM)作为甲基供体。甲基化反应广泛存在于生物体内，他们的作用底物范围几乎囊括了细胞内所有生物活性分子，包括核酸、蛋白质、多糖、脂类以及诸多小分子，因此许多重要的生理环节如基因表达的抑制或关闭、DNA损伤的修复，以及微生物、动植物体内生理过程中间产物的合成与降解反应等都涉及到MT的调控作用。按照目前的研究甲基转移酶可分为两类：遗传物质甲基转移酶和非遗传物质甲基转移酶。遗传物质甲基转移酶催化遗传物质胞嘧啶生理性的甲基化和由诱变物质导致的作为遗传物质附加体的甲基化。催化胞嘧啶甲基化的MT已经发现有6种，其中DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,Dnmt)Dnmt1，Dnmt2，Dnmt3为哺乳动物的DNA甲基转移酶。MT1、MT3则是存在于植物体内的同源化甲基转移酶，此外染色质甲基转移酶(Chromomethylase,CMT)是植物所特有的一种MT。催化非遗传物质的甲基转移酶种类非常多，从参与染色体的形成到激素的合成都与其有一定的关联，其作用的底物非常广泛，包括激素类、蛋白质残基、黄酮、叶绿素、无机砷、磷酸甘油酯类等，表1中列举了目前研究较多的催化非遗传物质的甲基转移酶。表1MT在体内催化SAM和底物，将甲基转移至底物并生成SAH(S-腺苷同型半胱氨酸)和甲基化物。以同型半胱氨酸甲基转移酶(Homocysteine Methyltransferase,HMT)为例，酶促反应如下：SAM是生物体内最常见的中间代谢产物。在蛋氨酸循环中，首先必须活化Met，形成SAM，SAM把甲基提供给生命过程中重要物质如DNA，RNA，脂蛋白,激素,神经递质等后变成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)，SAH脱去腺苷后生成同型半胱氨酸(Hcy)，最后通过四氢叶酸提供的甲基,又变成Met。在肝脏中，蛋氨酸循环有个额外的功能，主要是在高蛋氨酸或高蛋白饮食后，用以迅速清除血液中过高的蛋氨酸，最后通过同型半胱氨酸、半胱氨酸、胱硫醚、谷胱甘肽被转运到其它器官。SAM是自然界中仅有的几个功能极其多样而重要的含硫的生物活性物质，是蛋氨酸循环中的关键物质，是人类至关重要的甲基化修饰过程中甲基的唯一供体。在转甲基、转硫、转氨丙基反应中有重要的地位。对于甲基化相关的细胞功能、多胺合成、调节蛋氨酸与同型半胱氨酸的比例等有直接的影响。在各种生命重要的代谢反应和细胞的增殖分化等有重要意义。研究表明,肝脏中维持一定浓度的SAM对于肝功能的发挥起着至关重要的作用。大约85％的甲基化反应和约50％的蛋氨酸代谢是在肝脏中进行的，不仅提示肝脏在调节血液蛋氨酸水平有重要的作用，而且提示SAM在调控肝细胞再生，分化以及对各种因素(酒精，化学物质，辐射，病原微生物，病毒，寄生虫等)造成的肝细胞损伤的敏感性的重大意义。在甘氨酸N-甲基转移酶(GNMT)缺失的小鼠中，SAM水平上升，这两种情况下，小鼠出现肝癌的几率明显增加。编码依赖于SAM的甲基转移酶的基因占人类基因组的基因总数的1％。很多研究表明MT与其甲基底物在人体生命活动的不同阶段，如胚胎发生、发育、成长、分化、健康、疾病中起着至关重要的作用，就是因为SAM在蛋氨酸循环和一碳代谢中有非常重要的特殊作用，与人体新陈代谢状况直接相关。体内的SAM含量会因为年龄、性别、种族、体重、饮食、用药情况、健康和疾病状况而有所波动。鉴于这一特性，我们应该从SAM的合成和分解代谢两个方面来考察原因。因此，了解MT在不同情况下生物活性的高低对于我们研究许多至关重要的代谢与健康问题有很大的实际意义。目前有三种办法测定MT的活性：方法一：同位素示踪微量分析法。用同位素标记的SAM作为甲基供体，以目标酶的另一底物作为甲基受体，在固定条件下，测定单位时间内转移到另一底物上的同位素液闪每分计数值表示MT的相对活性；方法二：高压液相(HPLC)或质谱(LC-MS/MS)方法测定MT催化合成SAH或甲基化产物的量；方法三：多酶循环法。MT酶与SAM及其对应的甲基受体物质反应生成的SAH经SAH水解酶等进一步催化最终合成光化学方法可检测的NAD+。其中，同位素示踪法虽然具有灵敏度高、定位定量准确等优点，但也存在一些缺陷，该方法需要繁琐的底物与产物后续色谱分离，费时费力，而且重复性差，大部分情况下只能做到半定量分析，从事放射性同位素的工作人员必须经过专门训练，同时还需要具备一定的安全防护措施。作为示踪元素的放射性同位素与相应的普通元素之间存在化学性质的微小差异从而引起个别性质上的明显区别，尤其是对于轻元素而言，这种所谓的同位素效应比较严重。此外，该方法还有可能造成放射性污染。高压液相(HPLC)方法测定SAH或甲基化产物的方法也存在一定的局限性。其实无论是HPLC或LC-MS/MS哪种方法测定SAH或甲基化产物含量，对于评估MT活性都是很不准确的。HPLC和LC-MS/MS的样品，需要特殊处理，经过较长时间、较多步骤后SAH或甲基化产物必然有丢失，此外合成反应的产物有可能不稳定，甚至在短时间内降解，若不及时检测将造成检测值偏差。所有这些因素都会造成所测的值很不准确，更不用说试图达到反映酶动力学反应的目的。至于多酶循环法，常涉及到两种甚至两种以上的酶反应，过程复杂，影响因素甚多，且检测方法需要使用生化仪这类大型的昂贵仪器。因此，研发出一种能准确、快速、直接测定以SAM为甲基供体的甲基转移酶生物学活性的检测方法是非常必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能准确、快速、实时、直接测定以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体的甲基转移酶生物学活性的方法以及与该方法配套的试剂盒。本专利技术基于同时法直接测定其合成的S-腺苷同型半胱氨酸产物含量。只要待检测的MT能以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体，MT将SAM的甲基转移至与其相应的另一底物，SAM转化为SAH，无论体内还是体外方法测定MT酶活性，本专利技术都可以最直接地第一时间快速地测定SAH的含量，以推算MT活性的高低。本专利技术的创新之处在于让MT催化的生化反应与测定SAH的免疫反应同时进行，把这两个过程有机地结合起来，抗S-腺苷同型半胱氨酸特异性抗体快速、简便地测定以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体的一类甲基转移酶生物学活性，并通过大量试验探索出一套让这两个反应同时进行并获得最佳检测效果的最佳反应体系和条件。对于准确地测定分子性状极其不稳定的SAH尤其具有重大的意义。本专利技术甲基转移酶活性实时测定方法，包括在一个反应体系内两个同时进行的反应：(1)在保证以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体的甲基转移酶有生物学活性的缓冲体系中，加入含有甲基转移酶的样品、甲基供体和底物或者直接在含有甲基转移酶的液态样品中加入S-腺苷蛋氨酸甲基供体和底物，进行反应以便产生S-腺苷同型半胱氨酸产物，底物为甲基的受体物质；(2)利用免疫学方法检测S-腺苷同型半胱氨酸的含量，来确定反应体系中甲基转移酶的活性。所述的甲基转移酶活性实时测定方法，利用包被抗原法和包被抗体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种甲基转移酶活性实时测定方法，其特征在于，包括在一个反应体系内两个同时进行的反应：(1)在保证以S‑腺苷蛋氨酸为甲基供体的甲基转移酶有生物学活性的缓冲体系中，加入含有甲基转移酶的样品、甲基供体和相应的底物或者直接在含有甲基转移酶的液态样品中加入SAM甲基供体和相应的底物，进行反应以便产生S‑腺苷同型半胱氨酸产物，底物为甲基的接受体物质；(2)利用免疫学方法检测SAH的含量，来确定反应体系中甲基转移酶的活性。

【技术特征摘要】
1.一种甲基转移酶活性实时测定方法，其特征在于，包括在一个反应体系内两个同时进行的反应：(1)在保证以S-腺苷蛋氨酸为甲基供体的甲基转移酶有生物学活性的缓冲体系中，加入含有甲基转移酶的样品、甲基供体和相应的底物或者直接在含有甲基转移酶的液态样品中加入SAM甲基供体和相应的底物，进行反应以便产生S-腺苷同型半胱氨酸产物，底物为甲基的接受体物质；(2)利用免疫学方法检测SAH的含量，来确定反应体系中甲基转移酶的活性。2.根据权利要求1所述的甲基转移酶活性实时测定方法，其特征在于，利用包被抗原法和包被抗体法两种方式的竞争法测量S-腺苷同型半胱氨酸的含量；1)包被抗原法：预先将偶联的SAH抗原包被在固相酶联板中，同时加入待检抗原和示踪物标记的抗SAH抗体，待检抗原即生化反应产生的产物SAH，待检抗原与包被抗原共同竞争示踪物标记的抗SAH抗体，反应后洗板，与包被抗原结合的示踪物标记的抗SAH抗体保留，与待检抗原结合的示踪物标记的抗体则被洗掉，最后加入底物显色，最终显色结果与待检抗原量成反比，在测定过程中，用配制的一系列梯度已知量的SAH作为标准品，制作标准曲线；2)包被抗体法：先将羊或兔抗鼠IgG包被的微孔板中加入抗SAH抗体孵育，或者直接包被抗SAH抗体，洗板；加入示踪物标记的SAH抗原，再加入待检抗原，待检抗原即生化反应产生的产物SAH，待检抗原与示踪物标记的SAH竞争包被在酶联板上的抗SAH特异性抗体，孵育洗板；加入底物显色，在测定过程中，用配制的一系列梯度已知量的SAH作为标准品，制作标准曲线。`3.根据权利要求2所述的甲基转移酶活性实时测定方法，其特征在于，采用SAH抗原的类似物替代SAH抗原进行偶联或者示踪物标记。4.根据权利要求2所述的甲基转移酶活性实时测定方法，其特征在于，采用包被抗原法的具体步骤如下：(1)不同浓度标准品的配制：取S-腺苷同型半胱氨酸标准品，用缓冲液配制成不同浓度的标准曲线样品；(2)在包被有蛋白-SAH偶联物或多聚体-SAH偶联物的微孔板中，加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗S-腺苷同型半胱氨酸单克隆抗体，含有S-腺苷蛋氨酸、待测甲基转移酶的样品及与待测甲基转移酶相应的甲基接受体物质的缓冲液体系；如果是液态样品，则直接加入S-腺苷蛋氨酸、待测甲基转移酶的样品及与待测甲基转移酶相应的甲基接受体物质；标准曲线孔中加入配制好的不同浓度梯度的SA...

【专利技术属性】
技术研发人员：郝秀娟，周敏，
申请(专利权)人：湖南天合生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43