一种检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸制造技术

本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，所述的纤维素膜层上设有用偶联AFB1的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述的荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体为氧化石墨烯荧光纳米材料、NaYF4:Yb,Tm纳米颗粒或NaGd(WO4)2：Eu3+纳米颗粒标记的AFB1单克隆抗体或者多克隆抗体。本发明专利技术的试纸条具有特异性强、灵敏度高、稳定性高、安全性好、简便、快速的特点，在便携式荧光读数仪下可实现现场定量检测，能满足不同层次人员的需要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种免疫层析试纸，特别是涉及一种检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸。
技术介绍
黄曲霉毒素B1(Aflatoxin B1，称AFB1)是由黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)和特曲霉(Aspergillus nomius)产生的真菌次级代谢产物。AFB1常天然存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中，检出率高，具有强烈的毒性和致癌性，属于I类致癌物。我国AFB1对粮食和饲料的危害有不少报道，检出率高达80％～100％，可抑制动物免疫机能，降低动物生产性能，引起动物继发感染，甚至死亡，同时还可在动物产品中残留而威胁人类健康。因此针对AFB1开展有效的快速检测很有意义。我国国家标准GB 13078规定，在玉米、花生饼(粕)、棉籽饼(粕)、豆粕中AFB1最高残留限量≤50μg/kg，在畜禽类饲料中AFB1最高残留限量≤20μg/kg。目前，用于AFB1的检测方法主要有生物鉴定法、化学分析法、仪器分析法和免疫分析法4大类。生物鉴定法的优点是待检样品不需很纯，缺点是灵敏度低、实验周期较长。化学分析法的优点是经济实用，但不能准确定量，且分析结果的可重复性和再现性差。仪器分析法具有高分离、高检测效能及快速分析能力等优势，但对样品的前处理要求高，对操作人员技术要求高，且仪器设备价格昂贵，不适于快速检测。免疫分析法操作简单，成本低，而且具有较好的准确性和灵敏性，同时能进行定性和半定量或一定定量的检测，适合于对大量样品的筛查，是目前优先发展的检测技术。未修饰的氧化石墨烯表现出很弱的荧光，在紫外光照射下用肉眼基本上观察不到荧光。这是由于氧化石墨烯纳米片表面有很多含氧基团，例如纳米片表面上的环氧键和羟基，纳米片侧面的羧基，这些基团通常能诱导电子-空穴对的非辐射复合，从而导致氧化石墨烯的荧光很弱。经过正丁胺修饰以后，氧化石墨烯纳米片表面的环氧键和羧基都被反应掉，这将极大地降低其非辐射复合能力。因此修饰后，氧化石墨烯表现出很强的荧光可作为新型标记物在生物检测领域应用。虽然胶体金试纸在此方面应用较广，但其不能做到定量检测，作为更敏感、稳定、灵活、安全的氧化石墨烯荧光层析试纸的研究，是胶体金免疫检测技术的有力补充。上转换荧光纳米颗粒经过表面修饰与活化后，作为新型标记物在生物检测等领域进行应用。因其独特的物理结构和光学特性，使上转换荧光免疫试纸法与理化检测与微生物检测技
术相比，具有灵敏度高，操作过程简单，成本低及能进行大批量现场检测的特点；与胶体金试纸相比，具备定量检测的特色，作为更敏感、稳定、灵活、安全的UPT-LF的研究，是胶体金免疫检测技术的有力补充。但是目前上转换荧光材料的制备和试纸的研究仍存在发光效率不够，荧光材料种类少等缺陷，丞待加强该方面的研究和探讨。下转换荧光纳米颗粒具有高灵敏度，是一种完全惰性的无机发光材料，具有独特物理结构和光学特性，可作为新型标记物应用在生物检测领域。将其与生物学、免疫学、材料学相结合而开发的用于AFB1快速检测的下转换荧光纳米颗粒标记免疫层析方法，在灵敏、稳定、灵活方面显示了优异的特性，是胶体金免疫检测技术的有利补充。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，该试纸具有特异、灵敏、快速、简便等特点，能定量检测食品、饲料、中草药、尿液中的黄曲霉毒素B1。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层，所述的纤维素膜层上设有用偶联AFB1的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹；所述的荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体为氧化石墨烯荧光纳米材料、NaYF4:Yb,Tm纳米颗粒或NaGd(WO4)2：Eu3+纳米颗粒标记的AFB1单克隆抗体或者多克隆抗体。所述的支撑体包括设置在吸附层底面的底层和设置在吸附层顶面的面层。所述的支撑体包括透明的中空管体，吸附层填充在中空管体内部，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层。所述的中空管体的上端装有连接头，连接头上端设置有辅助吸附装置，所述的辅助吸附装置包括与所述连接头呈密封连接的连接套和设置在所述连接套上部的气囊，气囊的出气口依次经连接套上部的进气通道、连接头的内腔与中空管体的上口部相连通，进气通道所在的连接套侧壁上设置有只能向外排气无法向内吸气的单向出气装置。所述的单向出气装置包括设置在进气通道所在的连接套侧壁的换气腔，换气腔(111)内设置有圆球形的密封球，换气腔的底面上开有与密封球相对应的第一出气口，第一出气口经出气通道与进气通道相连通，换气腔侧面设置有与外界大气相连通的第二出气口，构成只能
向外排气、无法向进气通道吸气的单向出气结构。所述的第一出气口为圆形，其直径小于密封球的直径。所述的连接头为上下开口的中空结构，其下端与中空管体的上端呈密封连接，连接头上部的外壁上设置有外螺纹，连接套的下部设置有与连接头相对应的盲孔，盲孔内壁上设置有与外螺纹相对应的内螺纹，连接头通过外螺纹和内螺纹旋装在连接套下部的盲孔内，连接头的顶部与盲孔顶部之间在连接套上设置有防止漏气的密封圈。所述的隐形检测印迹和隐形对照印迹呈相间设置在纤维素膜层的表面，间距为8-15mm。所述的中空管体的内腔为长方形。所述的氧化石墨烯荧光纳米材料是一种以氧化石墨烯为基质通过酰氯化反应和烷基胺来修饰后，用银纳米颗粒进行表征后得到的荧光纳米材料。所述的氧化石墨烯荧光纳米材料标记的AFB1单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)氧化石墨烯荧光材料修饰：取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超声混匀后，加入20mL二氯亚砜，80℃下加热回流48h后离心，得到中间体酰氯化氧化石墨烯，用四氢呋喃洗涤两次后，干燥；再在抽真空氮气保护的条件下，将酰氯化氧化石墨烯和1mL正丁胺混合，60℃反应72h，冷却至室温，得到烷基胺修饰的氧化石墨烯，分散于20mL双蒸水中，8000r/min离心，除去未反应的正丁胺，将剩余的反应液通过旋转蒸发仪蒸干，蒸干后的干物质重新分散在双蒸水中，配制成浓度为1mg/mL的修饰的氧化石墨烯荧光材料水溶液；(2)表面标记AFB1抗体银纳米颗粒溶液的制备：(a)将100mg硝酸银溶解于250mL超纯水中，加热沸腾，加入10mL质量分数1％的柠檬酸钠溶液，80℃加热回流1h后搅拌0.5h，4℃条件下过夜；取1mL过夜后的溶液，加入1mM的巯基乙酸10μL，搅拌24h后离心，除去未反应的巯基乙酸，超纯水洗涤3次，用旋转蒸发仪蒸干，加超纯水配制成浓度为1mg/mL巯基乙酸包覆的银纳米颗粒溶液；(b)取0.1mM的EDC 10μL和0.1mM的NHS 10μL，逐步加入到1mL巯基乙酸包覆的银纳米颗粒溶液中，反应1h，得到羧基活化的银纳米颗粒溶液；(c)取0.1mM的AFB1单克隆抗体或多克隆抗体20μL，加入到羧基活化的银纳米颗粒溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层(2)、荧光抗体纤维层(3)、纤维素膜层(4)及吸水材料层(7)，其特征在于，所述的纤维素膜层上设有用偶联AFB1的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹(5)和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹(6)；所述的荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体为氧化石墨烯荧光纳米材料、NaYF4:Yb,Tm纳米颗粒或NaGd(WO4)2：Eu3+纳米颗粒标记的AFB1单克隆抗体或者多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，包括支撑体和固定在支撑体上的吸附层，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层(2)、荧光抗体纤维层(3)、纤维素膜层(4)及吸水材料层(7)，其特征在于，所述的纤维素膜层上设有用偶联AFB1的载体蛋白溶液印制的隐形检测印迹(5)和用羊抗小鼠IgG、兔抗小鼠IgG或羊抗兔IgG抗体溶液印制的隐形对照印迹(6)；所述的荧光抗体纤维层采用吸附荧光抗体的玻璃纤维棉制成，荧光抗体为氧化石墨烯荧光纳米材料、NaYF4:Yb,Tm纳米颗粒或NaGd(WO4)2：Eu3+纳米颗粒标记的AFB1单克隆抗体或者多克隆抗体。2.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的支撑体包括设置在吸附层底面的底层(15)和设置在吸附层顶面的面层(14)。3.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的支撑体包括透明的中空管体(1)，吸附层填充在中空管体内部，吸附层从测试端开始依次为吸附纤维层、荧光抗体纤维层、纤维素膜层及吸水材料层。4.根据权利要求3所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的中空管体(1)的上端装有连接头(8)，连接头(8)上端设置有辅助吸附装置，所述的辅助吸附装置包括与所述连接头呈密封连接的连接套(13)和设置在所述连接套上部的气囊(12)，气囊(12)的出气口依次经连接套(13)上部的进气通道(132)、连接头(8)的内腔(9)与中空管体(1)的上口部相连通，进气通道所在的连接套侧壁上设置有只能向外排气无法向内吸气的单向出气装置(11)；所述的单向出气装置包括设置在进气通道所在的连接套侧壁的换气腔(111)，换气腔(111)内设置有圆球形的密封球(113)，换气腔(111)的底面上开有与密封球相对应的第一出气口(114)，第一出气口经出气通道(115)与进气通道(132)相连通，换气腔(111)侧面设置有与外界大气相连通的第二出气口(112)，构成只能向外排气、无法向进气通道吸气的单向出气结构。5.根据权利要求4所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的第一出气口(114)为圆形，其直径小于密封球的直径。6.根据权利要求4所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的连接头(8)为上下开口的中空结构，其下端与中空管体(1)的上端呈密封连接，连接头上部的外壁上设置有外螺纹，连接套(13)的下部设置有与连接头相对应的盲孔(131)，盲孔(131)内壁上设置有与外螺纹相对应的内螺纹，连接头通过外螺纹和内螺纹旋装在连接套
\t下部的盲孔(131)内，连接头的顶部与盲孔顶部之间在连接套上设置有防止漏气的密封圈(10)。7.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的隐形检测印迹(5)和隐形对照印迹(6)呈相间设置在纤维素膜层(4)的表面，间距为8-15mm；所述的中空管体(1)的内腔为长方形。8.根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的荧光免疫层析试纸，其特征在于，所述的氧化石墨烯荧光纳米材料标记的AFB1单克隆抗体或者多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：(1)氧化石墨烯荧光材料修饰：取20mg氧化石墨磨碎，加入到5mL DMF中，超声混匀后，加入20mL二氯亚砜，80℃下加热回流48h后离心，得到中间体酰氯化氧化石墨烯，用四氢呋喃洗涤两次后，干燥；再在抽真空氮气保护的条件下，将酰氯化氧化石墨烯和1mL正丁胺混合，60℃反应72h，冷却至室温，得到烷基胺修饰的氧化石墨烯，分散于20mL双蒸水中，8000r/min离心，除去未反应的正丁胺，将剩余的反应液通过旋转蒸发仪蒸干，蒸干后的干物质重新分散在双蒸水中，配制成浓度为1mg/mL的修饰的氧化石墨烯荧光材料水溶液；(2)表面标记AFB1抗体银纳米颗粒溶液的制备：(a)将100mg硝酸银溶解于250mL超纯水中，加热沸腾，加入10mL质量分数1％的柠檬酸钠溶液，80℃加热回流1h后搅拌0.5h，4℃条件下过夜；取1mL过夜后的溶液，加入1mM的巯基乙酸10μL，搅拌24h后离心，除去未反应的巯基乙酸，超纯水洗涤3次，用旋转蒸发仪蒸干，加超纯水配制成浓度为1mg/mL巯基乙酸包覆的银纳米颗粒溶液；(b)取0.1mM的EDC 10μL和0.1mM的NHS 10μL，逐步加入到1mL巯基乙酸包覆的银纳米颗粒溶液中，反应1h，得到羧基活化的银纳米颗粒溶液；(c)取0.1mM的AFB1单克隆抗体或多克隆抗体20μL，加入到羧基活化的银纳米颗粒溶液中，4℃反应过夜，得到表面标记AFB1抗体银纳米颗粒溶液；(3)氧化石墨烯荧光纳米材料AFB1抗体的标记：取修饰的氧化石墨烯荧光材料水溶液5mL，加入2mL戊二醛，室温反应3h，离心，除去未反应的戊二醛，将剩余的反应液分散在0.01mol/L、pH7.4的PBS缓冲溶液中，加...

【专利技术属性】
技术研发人员：李靖靖，职爱民，聂卉，赵国欣，王岚，闵玉涛，张小梅，孙浩冉，郭林，杨联芝，
申请(专利权)人：中州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41