本发明专利技术公开了一种六次甲基四胺的检测试剂盒，包括检测卡、胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物以及磷酸盐缓冲稀释液。同时，本发明专利技术还提供了一种六次甲基四胺的检测方法和应用。该试剂盒及其检测方法可以定性及半定量检测样品中是否含有待测物以及待测物含量的大致范围。本发明专利技术提供的试剂盒中检测卡结构简单，成本低，检测所需时间短，能够同时快速检测大批样品，而且检测结果准确，应用性强，操作简单，可实现腐竹、粉丝、水产品中六次甲基四胺的快速、准确地检测，这对于维护广大消费者利益及保障政府部门的食品安全监管工作具有重大意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品安全检测领域，具体地说是一种六次甲基四胺的检测方法。
技术介绍
六次甲基四胺（俗名乌洛托品），分子式C6H12N4，属化工原料，被卫生部列入第五批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中，六次甲基四胺被禁止添加到食品当中或在加工食品过程中使用。部分违法者将其掺入腐竹、粉丝、水产品等食品中，会起到增白、保鲜、增加口感、防腐的效果。六次甲基四胺本身属低毒类，可作为药物服用。但其在酸性条件下，能分解出甲醛，甲醛易与体内多种化学结构的受体发生反应，如与氨基化合物可以发生缩合，与巯基化合物加成，使蛋白质变性。甲醛在体内还可还原为醇，故可表现出甲醇的毒理作用，对人体的肾、肝、中枢神经、免疫功能、消化系统等均有损害。目前，国家标准中还没有关于六次甲基四胺的指定检测方法，六次甲基四胺属于小分子物质，如想要对其进行检测，主要采用仪器检测的方法，比如高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）、液相色谱串联质谱法（LC-MSMS）等。这些方法虽然可以精确地进行定性及定量检测分析，但是存在检测仪器昂贵、成本高、需要专门的技术人员来检测、检测时间长、方法操作复杂等缺陷，尤其不适用于食品安全监管现场的快速检测。免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。它可以克服仪器检测法的上述缺陷，能够以其简单、快速、灵敏度高、特异性强、结果直观、无需仪器等高效地应用于食品安全检测领域。免疫学检测方法中应用较广泛的是酶联免疫法，简称ELISA法。但是ELISA法相对更适用于定量检测方法，检测时间相对较长，不适于快速定性检测。因此，为适应市场需求，行业内迫切需要开发一种简单、快速、灵敏度高、特异性强、结果直观、无需精密仪器的六次甲基四胺的定性检测装置及检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种六次甲基四胺的检测试方法，以解决在食品安全检验时，现有方法无法快速、准确地、大批量定性或半定量检测六次甲基四胺的问题。本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种六次甲基四胺的检测试剂盒，其特征在于，包括：检测卡；所述检测卡包括硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜上设有一条含六次甲基四胺包被抗原的检测带和一条含有羊抗兔二抗的质控带；胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物；以及磷酸盐缓冲稀释液。所述六次甲基四胺包被抗原是通过以下方法制备的：配制浓度为15-25mg/ml的六次甲基四胺溶液；配置浓度为0.1mol/L、pH值为7.4、含有卵清蛋白4.5-5.0mg/ml的磷酸盐缓冲液；将六次甲基四胺溶液缓慢滴加到含卵清蛋白磷酸缓冲溶液中，之后，再加入体积比浓度为25%戊二醛水溶液，混匀，室温静置1小时，4℃静置过夜，装入透析袋，4℃下在0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中连续透析5天，每天换液1次，得到的六次甲基四胺包被抗原；所述六次甲基四胺: 含卵清蛋白的磷酸缓冲溶液:戊二醛水溶液的添加比例为5-6 mg : 2-5ml : 1-2 ml。所述胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物是通过以下步骤制备的：（A）合成六次甲基四胺完全抗原：配制浓度为200-300mg/ml的六次甲基四胺溶液；配制pH值为7-10、离子浓度为10-1000 mmol、含载体蛋白30-50 mg/ml的复合磷酸盐缓冲液；所述载体蛋白为牛血清白蛋白；将所述六次甲基四胺溶液滴加到所述复合磷酸盐缓冲液中，再加入体积比浓度为25%的戊二醛水溶液，混匀，室温静置1-2小时，4℃冰箱过夜，再装入透析袋中，透析3-5天，每天换液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原；所述六次甲基四胺:复合磷酸盐缓冲液:戊二醛水溶液质量体积比为：80-120 mg : 1-5ml : 2-3ml；（B）制备六次甲基四胺多克隆抗体：采用所述六次甲基四胺完全抗原进行动物免疫，获得六次甲基四胺多克隆抗体；（C）制备胶体金溶液：将100 ml质量比浓度为0.01%的HAuCl4水溶液用恒温磁力搅拌器加热至沸腾，保持煮沸2-3 min，搅拌，加入1.2 ml质量比浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，待溶液颜色变为透明的红色并不再变化时，保持煮沸15 min，停止加热，搅拌，冷却至室温，用蒸馏水恢复至100 ml；（D）制备胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物：调节胶体金的pH值为8-10，按体积比为1:0.06取所述胶体金和所述六次甲基四胺多克隆抗体，在磁力搅拌下，将所述六次甲基四胺多克隆抗体逐滴加入到胶体金溶液中，10-15 min后向溶液中逐滴加入牛血清白蛋白，使溶液中所述牛血清白蛋白的终浓度达到1-2%，搅拌30-40 min，置于4℃下过夜；在4℃下1500r/min离心10min，取上清液于4℃下、10000r/min离心30min，弃去上清液，得胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物。所述制备六次甲基四胺多克隆抗体的方法为：采用初次免疫制剂对两只雄性大耳白家兔进行初次免疫，之后用加强免疫制剂分别于初次免疫后的第2周、4周、8周、12周各加强免疫1次，采用背部皮下脊柱两侧多点进行免疫，于最后一次免疫完第10天，从兔子的耳缘静脉取血，将血清收集于离心管中，室温静置30-35min，待血浆凝聚后，4℃静置过夜，将血清以3000 r/min离心15-20 min，得到的上清液为六次甲基四胺多克隆抗体。所述初次免疫制剂的制备工艺为将所述六次甲基四胺完全抗原按体积比为1:4溶于磷酸盐缓冲液中，得抗原磷酸缓冲液，在抗原磷酸缓冲液中加入与其等体积的弗氏完全佐剂，乳化即得；所述加强免疫制剂的制备工艺为将所述六次甲基四胺完全抗原按体积比为1:9溶于磷酸盐缓冲液中，得加强抗原磷酸缓冲液，在加强抗原磷酸缓冲液中加入与其等体积的弗氏不完全佐剂，乳化即得；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01 mol/L，pH值为7.4。所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01mol/L、pH值为7.4，为市售商品。所述质控带与检测带相互平行且间隔0.3-0.7cm；所述检测带用8-12μl的六次甲基四胺包被抗原划线而成，所述质控带用8-12μl的羊抗兔二抗稀释液划线而成，所述羊抗兔二抗稀释液是指将0.5μl的羊抗兔二抗用磷酸盐缓冲液稀释100倍。本专利技术提供的六次甲基四胺的检测试剂盒在食品安全检测中的应用。一种六次甲基四胺的检测方法，包括以下步骤：（a）合成六次甲基四胺完全抗原：配制浓度为0.16-0.3mg/ml的六次甲基四胺溶液；配制pH值为7-10、离子浓度为10-1000 mmol、含载体蛋白30-50 mg/ml的复合磷酸盐缓冲液；所述载体蛋白为牛血清白蛋白；将所述六次甲基四胺溶液滴加到所述复合磷酸盐缓冲液中，再加入体积比浓度为25%的戊二醛水溶液，混匀，室温静置1-2小时，4℃冰箱过夜，再装入透析袋中，透析3-5天，每天换液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原；所述六次甲基四胺:复合磷酸盐缓冲液:戊二醛水溶液质量体积比为：80-120 mg : 1-5ml : 2-3ml；（b）制备六次甲基四胺多克隆抗体：采用所述六次甲基四胺完全抗原进行动物免疫，获得六次甲基四胺多克隆抗体；（c）制备六次甲基四胺包被抗原：用卵清蛋白对所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种六次甲基四胺的检测方法，其特征在于，采用试剂盒检测六次甲基四胺，包括以下步骤：所述试剂盒，包括：检测卡；所述检测卡包括硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜上设有一条含六次甲基四胺包被抗原的检测带和一条含有羊抗兔二抗的质控带；胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物；以及磷酸盐缓冲稀释液；（1）预处理待测样品；（2）将所述胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物与磷酸盐缓冲液按1:2混合，将处理后的待测样品与所述胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物和磷酸盐缓冲液的混合物按体积比为1:5混合，得混合液；（3）将所述混合液逐滴加到所述检测卡的检测带与质控带之间的区域上； 静置10‑15min，观察，若质控带和检测带都显红色，则待测样品为阴性，即表明待测样品中不含六次甲基四胺或其含量小于 0.5ng/ml 最低检出限；若仅质控带显红色，则待测样品为阳性，即表明待测样品中含有六次甲基四胺且含量大于所述最低检出限，若质控带均不显色，则该测试无效；所述试剂盒中胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物的制备工艺包括以下步骤：（A）合成六次甲基四胺完全抗原：配制浓度为 200‑300 mg/ml 的六次甲基四胺溶液；配制pH值为7‑10、离子浓度为10‑1000 mmol、含载体蛋白30‑50 mg/ml的复合磷酸盐缓冲液； 所述载体蛋白为牛血清白蛋白；将所述六次甲基四胺溶液滴加到所述复合磷酸盐缓冲液中，再加入体积比浓度为25%的戊二醛水溶液，混匀，室温静置1‑2小时，4℃冰箱过夜，再装入透析袋中，透析 3‑5 天，每天换液 1‑2 次，得六次甲基四胺完全抗原；所述六次甲基四胺:复合磷酸盐缓冲液:戊二醛水溶液质量体积比为：80‑120 mg : 1‑5ml : 2‑3ml；（B）制备六次甲基四胺多克隆抗体：用所述六次甲基四胺完全抗原进行动物免疫，获得六次甲基四胺多克隆抗体；（C）制备胶体金溶液：将100 ml质量比浓度为0.01%的HAuCl4 的水溶液边搅拌边加热至沸腾，保持煮沸2‑3 min，搅拌，加入1.2 ml质量比浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，待溶液颜色变为透明的红色并不再变化时，保持煮沸 15 min，停止加热，搅拌，冷却至室温，添加蒸馏水恢复溶液至100 ml；（D）制备胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物：调节胶体金溶液的pH值为8‑10， 按体积比1:0.06取所述胶体金溶液和所述六次甲基四胺多克隆抗体，在磁力搅拌下，将所述六次甲基四胺多克隆抗体逐滴加入到所述胶体金溶液中，10‑15 min后向溶液中逐滴加入牛血清白蛋白，使溶液中所述牛血清白蛋白的终浓度达到1‑2%，搅拌 30‑40min，置于4℃下过夜； 在 4℃下1500r/min离心10min，取上清液于4℃下、10000r/min离心30min，弃去上清液，得胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物。...
【技术特征摘要】
1.一种六次甲基四胺的检测方法，其特征在于，采用试剂盒检测六次甲基四胺，包括以下步骤：所述试剂盒，包括：检测卡；所述检测卡包括硝酸纤维素膜，在所述硝酸纤维素膜上设有一条含六次甲基四胺包被抗原的检测带和一条含有羊抗兔二抗的质控带；胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物；以及磷酸盐缓冲稀释液；（1）预处理待测样品；（2）将所述胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物与磷酸盐缓冲液按1:2混合，将处理后的待测样品与所述胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物和磷酸盐缓冲液的混合物按体积比为1:5混合，得混合液；（3）将所述混合液逐滴加到所述检测卡的检测带与质控带之间的区域上； 静置10-15min，观察，若质控带和检测带都显红色，则待测样品为阴性，即表明待测样品中不含六次甲基四胺或其含量小于 0.5ng/ml 最低检出限；若仅质控带显红色，则待测样品为阳性，即表明待测样品中含有六次甲基四胺且含量大于所述最低检出限，若质控带均不显色，则该测试无效；所述试剂盒中胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物的制备工艺包括以下步骤：（A）合成六次甲基四胺完全抗原：配制浓度为 200-300 mg/ml 的六次甲基四胺溶液；配制pH值为7-10、离子浓度为10-1000 mmol、含载体蛋白30-50 mg/ml的复合磷酸盐缓冲液； 所述载体蛋白为牛血清白蛋白；将所述六次甲基四胺溶液滴加到所述复合磷酸盐缓冲液中，再加入体积比浓度为25%的戊二醛水溶液，混匀，室温静置1-2小时，4℃冰箱过夜，再装入透析袋中，透析 3-5 天，每天换液 1-2 次，得六次甲基四胺完全抗原；所述六次甲基四胺:复合磷酸盐缓冲液:戊二醛水溶液质量体积比为：80-120 mg : 1-5ml : 2-3ml；（B）制备六次甲基四胺多克隆抗体：用所述六次甲基四胺完全抗原进行动物免疫，获得六次甲基四胺多克隆抗体；（C）制备胶体金溶液：将100 ml质量比浓度为0.01%的HAuCl4 的水溶液边搅拌边加热至沸腾，保持煮沸2-3 min，搅拌，加入1.2 ml质量比浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，待溶液颜色变为透明的红色并不再变化时，保持煮沸 15 min，停止加热，搅拌，冷却至室温，添加蒸馏水恢复溶液至100 ml；（D）制备胶体金标记六次甲基四胺多克隆抗体复合物：调节胶体金溶液的pH值为8-10， 按体积比1:0.06取所...
【专利技术属性】
技术研发人员：王庭欣，周丽岩，孟墨，庞艳荣，王庭祥，谢飞，任勃儒，
申请(专利权)人：河北大学，
类型：发明
国别省市：河北;13
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。