本发明专利技术涉及用于检测SEPT9基因甲基化的组合物、试剂盒及方法。用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，包括上游检测引物和下游检测引物构成的引物对；所述上游检测引物包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；所述下游检测引物包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。还包括检测探针以及阻拦序列。本发明专利技术提供的利用一对引物、一条阻拦序列和一条探针检测患者血液中SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化水平的简易方法，具有成本低廉、检测方便、灵敏性高的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因甲基化快速分子诊断领域，具体涉及用于检测SEPT9基因甲基化的组合物与试剂盒以及方法。
技术介绍
结直肠癌(CRC)是世界第三常见恶性肿瘤，每年新发病例数约120万，约死亡病例数约61万人(2008年)。近20多年来，世界上多数国家结直肠癌(主要是结肠癌)发病率呈上升趋势。在美国每年约有15.4万新发直结肠癌患者，其中每年死亡人数超过5.2万。中国结直肠癌发病率上升趋势也十分明显。中国每年有超过40万新发直结肠癌患者，直结肠癌死亡19.5万，平均增速为4.2％远超过国际平均水平的2％。根据世界卫生组织统计表明，北美国家直结肠癌患者5年生存率约为60％，而中国对应仅有32％。直结肠癌生存期与疾病的严重程度、分期相关，由于我国在直结肠癌的诊断水平，民众早诊意识等方面薄弱，80％以上为中晚期患者，早期诊断比例仅为11.8％。而有效的早期直结肠癌患者可使直结肠癌发病率降低60％，病死率降低80％。目前，直结肠癌非侵入式检测方法用于疾病的筛查有效力非常低下，因为需要患者每年收集粪便样本便潜血试验或粪便免疫化学荧光检测，假阳性比率高，结果稳定性差，总体受检率小于3％。尽管乙状结肠镜检查或结肠镜检查检出率较高，是直结肠癌检查的金标准，但是需要患者做清理肠道准备、依靠麻醉并且侵犯隐私，患者会产生恐惧心理，检查出血或者感染等情况，总体依从性较差，受检率小于5％。因此，高特异性、高灵敏度、依从性好、非侵入式的直结肠癌早期诊断技术亟待解决。DNA甲基化是调节基因表达转录的表观遗传方式之一，普遍存在与哺乳动物中。DNA甲基化主要发生在基因上游启动子CpG到的胞嘧啶上，形成CpG基因岛，关闭下游基因的表达。异常的DNA甲基化对基因表达的调控是肿瘤发生发展中的重要特点之一，并且在直结肠癌中被广泛验证。近年来，研究者发现患者血浆中大量基因甲基化包括p16、BMP3、NDRG4、SEPT9等与直结肠癌的发生、发展相关。其中，SEPT9(或成为septin9)是广泛存在于真核生物中的进化上保守的细胞骨架GTPase蛋白，参与多项细胞生命活动包括细胞分裂、极化、细胞凋亡等。血浆中SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化与直结肠癌的发生和发展密切相关，基因甲基化情况能有效区分直结肠癌患者与健康人群，可单独作为直结肠癌诊断、预后的指标。针对SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化水平有CN201410452285.2、CN201410030771.5和CN201510264501.5。CN201410452285.2根据甲基化与非甲基化亚硫酸氢盐处理后序列不同，PCR扩增的温度溶解曲线不同而产生不同的荧光峰值，来对SEPT9基因甲基化进行检测与定量。然而高分辨溶解曲线仅能在如LightCyclerTM480PCR或LightScanner等少量仪器可以使用，并且技术要求高，不利于广泛推广。CN201410030771.5采用五对引物、五条Blocker和五条探针对SEPT9基因甲基化，检测成本较高，扩增反应复杂，易出现引物、探针干扰导致检测结果不稳定。CN201510264501.5通过引入脱氧次黄嘌呤核苷酸碱基(I)，检测时需同步进行两个反应体系，检测结果由两个反应体系进行比较获得，检测成本较高且结果判读复杂。
技术实现思路
本专利技术针对现有的不足，提供了一种利用一对引物、一条阻拦序列(即Blocker)和一条探针检测患者血液中SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化水平的简易方法，具有成本低廉、检测方便、灵敏性高的特点。本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示，为GCGCGATTCGTTGTTTATTAGTTATTATGATTTGTTAATAGTTGGATGGGATTATTTCGG，其中，加粗部分核苷酸为SEPT9基因V2拼接体启动子甲基化位点。本专利技术提供一种用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，包括上游检测引物和下游检测引物构成的引物对；所述上游检测引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为5'-AAATAATCCCATCCAACTA-3'；所述下游检测引物包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.2所示的核苷酸序列为5'-TTAACCGCGAAATCCGAC-3'。用上述引物对扩增的PCR产物的尺寸均在40bp至200bp的范围中，这可以使得能够在短时间内特异性基因。利用本专利技术提供的上述引物检测人直结肠癌基因基因甲基化时，与传统检测方法相比，本专利技术具有检测方便、灵敏度高和特异性好等优点。进一步，还包括具有阻拦序列的DNA片段，所述阻拦序列的DNA片段用于结合非甲基化SEPT9基因，在甲基化SEPT9基因经过亚硫酸氢盐转化后的产物中，该阻拦序列的DNA片段在PCR反应退火过程中优先于上述的引物对结合非甲基化SEPT9基因。进一步，所述阻拦序列包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，优选地，所述阻拦序列为SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，并在3'端具有3'-SpacerC3，为5'-GTTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTAG-C3-3'。C3(即3'-SpacerC3，dSpC3)主要用于模仿核糖的3'和5'羟基间的三碳间隔，或“替代”一个序列中未知的碱基。C3用于引进一个3'间臂从而阻止3'端外切酶和3'端聚合酶发挥作用。上述序列可以阻拦上游检测引物与非甲基化SEPT9基因结合。进一步，还包括检测探针，所述检测探针与引物对中的上游检测引物或下游检测引物匹配。进一步，所述检测探针包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列；优选地，所述检测探针为SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。进一步，所述检测探针的5'端标记有荧光基团，所述检测探针的3'端标记有淬灭基团。上述探针可选用下述任一荧光基团在其5'端标记：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED，选用下述任一淬灭基团在其3'端标记：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(MinorGrooveBindernonfluorescentquencher,MGBNFQ)。优选地，荧光标记物选择FAM，淬灭剂选择BHQ-1。进一步，还包括内标引物对和内标探针；所述内标引物对包括上游内标引物和下游内标引物，为用于扩增β-actin基因；上游本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，包括上游检测引物和下游检测引物构成的引物对；所述上游检测引物包括SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列为5′‑AAATAATCCCATCCAACTA‑3′；所述下游检测引物包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列为5′‑TTAACCGCGAAATCCGAC‑3′。
【技术特征摘要】
1.用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，包括上游检测引物和下游检测引
物构成的引物对；
所述上游检测引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.1所示的核苷
酸序列为5′-AAATAATCCCATCCAACTA-3′；
所述下游检测引物包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，所述SEQIDNO.2所示的核苷
酸序列为5′-TTAACCGCGAAATCCGAC-3′。
2.根据权利要求1所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，还包括阻拦
序列，所述阻拦序列用于结合非甲基化SEPT9基因，在甲基化SEPT9基因经过亚硫酸氢盐转
化后的产物中，该阻拦序列在PCR反应退火过程中优先于权利要求1所述的引物对结合非甲
基化SEPT9基因。
3.根据权利要求2所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，所述阻拦序
列包括SEQIDNO.3所示的核苷酸序列，并在3′端具有3′-SpacerC3。
4.根据权利要求1至3任一项所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，还
包括检测探针，所述检测探针与引物对中的上游检测引物或下游检测引物匹配。
5.根据权利要求4所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，所述检测探
针包括SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征在于，所述检测探
针的5′端标记有荧光基团，所述检测探针的3′端标记有淬灭基团。
7.根据权利要求1、2、3、5或6任一项所述用于检测SEPT9基因甲基化的组合物，其特征
在于，还包括内标引物对和内标探针；
所述内标...
【专利技术属性】
技术研发人员：张良禄，殷雷，洪昊岩，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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