本发明专利技术公开了SFRP1基因启动子区多CG位点甲基化检测的引物和方法包括：(1)扩增SFRP1基因启动子区的正、反向兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2；(2)上述引物扩增的目标序列包括至少7个CG位点；(3)针对石蜡切片DNA片段化严重，而亚硫酸氢盐修饰饱和状态下仍呈现有效模板浓度低的问题，将Touch‑down PCR扩增和Sanger测序相结合，可显著提高检测灵敏度。本发明专利技术具有特异性高，准确度高以及低污染风险等优点，可检测肿瘤患者手术石蜡切片SFRP1基因启动子区多个CG位点甲基化，结果可指导医生进行相关疾病的预后评估。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生命科学和生物
，是一种检测SFRP1基因启动子甲基化状态的引物和检测方法。
技术介绍
SFRPl基因位于染色体8p12-11.1，编码大约30KDa的蛋白质，是在胚胎发育时期参与眼、脑、血管系统的形成和细胞分化，成体中也主要表达与脑的脉络膜、眼的视网膜及晶状体、睫状体、血管内皮等组织，参与这些组织的代谢和功能。SFRPl作为分泌性的Wm信号上游抑制因子，位于细胞外，含有一个CRD(半胱氨酸富含域)结构域，其氨基端部分序列与Frz类似，它的作用机制可能是与Frz竞争结合Wnt蛋白或与Frz结合成无功能的复合体，从而阻断Wnt信号转导。SFRPl基因失活或功能异常与多种人类肿瘤有关，目前已经在结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、乳头状膀胱癌、食管腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等中检测到该基因频繁的甲基化失活。研究者在胃癌及相应的癌旁组织中检测SFRPl基因启动子甲基化率分别是44％和15％，两者比较差异有统计学意义，癌组织SFRPl mRNA表达明显减少并且与甲基化有相关性。用脱甲基化试剂作用胃癌细胞株后显示SFRPl mRNA表达恢复，说明甲基化介导的SFRPl基因沉默参与胃癌形成；研究者还发现SFRPl基因表达与肿瘤分级和分期负相关，表明SFRPl参与结直肠癌发展。研究者发现SFRPl基因甲基化在结直肠癌中高达85％，而且SFRPl mRNA表达与甲基化明显呈负相关，由此认为SFRPl基因甲基化参与结直肠癌的发病。SFRPl在肝细胞癌中的作用文献报道较少，一篇报道在HCC细胞株和癌组织中SFRPl基因甲基化率分别为75％、48.2％，而正常肝组织中无甲基化现象，说明SFRPl基因甲基化是HCC中的共同事件，在HCC发病中起重要作用。大量研究表明，SFRPl基因启动子甲基化不仅在科研有重要作用，研究者发现SFRPl基因启动子甲基化是早期发现肿瘤良好的标志物。SFRPl基因甲基化在结直肠癌组织中的比例达93.1％，在大肠腺瘤中的发生率为87.9％，而在正常粘
膜无甲基化出现，进一步提示SFRPl基因启动子异常甲基化可能是一种比较理想的结直肠癌早期诊断标志物，结合粪便DNA提取技术，将其用于粪便DNA检测有望获得结直肠癌诊断的高敏感性和特异性。同时，SFRPl基因启动子甲基化是提示预后的良好的分子标志物，研究者发现SFRPl基因表达与肿瘤分级和分期负相关，而SFRPl基因的表达对于肿瘤抑制至关重要，研究表明，SFRPl基因启动子甲基化提示较差的预后。目前对于SFRPl启动子甲基化检测的常规方法有：甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐焦磷酸测序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)，甲基化特异性PCR(MS-PCR)等。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否存在甲基化，该法实用且普遍，但假阳性较高，稳定性较差；亚硫酸氢盐焦磷酸测序因其操作繁琐，因此不适合大批量检测；MS-HRM是通过将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，同时该法只能分析检测片段整体甲基化状态，而不能明确每个CG位点的甲基化状态；MS-PCR是基于PCR开发的技术，主要是在检测中加入了TaqMan探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但其对于多个甲基化位点的检测，也只能做到整体化分析，同时探针成本较高，因此该法较适用于少数位点大量样本检测。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：设计用于检测SFRP1基因启动子甲基化的引物，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO2，其序列为：SEQ NO 1：5’-CGGTGACGGACGTGGTAAYGAG-3’；SEQ NO 2：5’-CGACTCCCGAAAATACGACRAACA-3’。所述SEQ NO 1和SEQ NO 2也可作为测序引物。本专利技术提供的另一个技术方案是：用于检测SFRP1基因启动子甲基化的方法，包括：(1)提取样本中的DNA；(2)将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2扩增SFRP1基因片段，获得PCR扩增产物；(4)对步骤(3)中获得的产物测序；(5)根据步骤(4)的测序结果，得到序列CG位点的甲基化结果；其中，PCR扩增反应条件为：第一阶段，92-97℃预变性5-15min；第二阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度62-66℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环12-18次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度53-57℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24-34次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。所述的测序为Sanger测序，测序引物为：SEQ NO 1：5’-CGGTGACGGACGTGGTAAYGAG-3’；SEQ NO 2：5’-CGACTCCCGAAAATACGACRAACA-3’。该方法检测的样本为石蜡切片样本、全血样本、新鲜组织样本或细胞系样本。更进一步地，本专利技术提供一种用于检测SFRP1基因启动子甲基化的试剂盒的技术方案，包括亚硫酸盐修饰、PCR扩增试剂以及Sanger测序试剂、阳性对照品、阴性对照品，其中：(1)亚硫酸盐处理试剂包括：Bisulfite Mix、RNase free water、DNA Protect Buffer；(2)PCR扩增试剂：10*PCR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq酶、10uM扩增引物(SEQ NO1、SEQ NO 2)以及灭菌水；(3)酶纯化试剂：EXOI、CIP；(4)测序试剂：Bigdye Terminator V3.1、无水乙醇、EDTA、及测序引物(SEQ NO 1、SEQ NO 2)。其中，阳性对照品为经过所有胞嘧啶甲基化修饰的全甲基化正常人群血液基因组DNA，阴性对照品为正常人群血液基因组DNA。本专利技术采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法SFRPl启动子甲基化检测，针对石蜡切片DNA片段化严重，在造成亚硫酸氢盐处理饱和的情况下，仍出现的有效模板浓度很低的情况，Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与
样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。由于DNA序列在经亚硫酸盐处理后，其部分C碱基会转变为T，导致序列区域内CG含量和TM值发生较大程度的变异，进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序列。因此，本专利技术中PCR采用的扩增引物以及测序引物均为自行设计，其中测序引物使用兼并碱基，从本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测SFRP1基因启动子甲基化的引物，其特征在于，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’‑CGGTGACGGACGTGGTAAYGAG‑3’；SEQ NO 2：5’‑CGACTCCCGAAAATACGACRAACA‑3’。
【技术特征摘要】
1.用于检测SFRP1基因启动子甲基化的引物，其特征在于，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’-CGGTGACGGACGTGGTAAYGAG-3’；SEQ NO 2：5’-CGACTCCCGAAAATACGACRAACA-3’。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，扩增引物同为测序引物，所述测序引物的序列为：SEQ NO 1：5’-CGGTGACGGACGTGGTAAYGAG-3’；SEQ NO 2：5’-CGACTCCCGAAAATACGACRAACA-3’。3.一种用于检测SFRP1基因启动子甲基化的方法，包括：(1)提取样本中的DNA；(2)将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2扩增SFRP1基因片段，获得PCR扩增产物；(4)对步骤(3)中获得的产物测序；(5)根据步骤(4)的测序结果，得到序列CG位点的甲基化结果；其所述引物序列为：SEQ NO 1：5’-CGGTGACGG...
【专利技术属性】
技术研发人员：林有升，单战，王淑一，
申请(专利权)人：杭州艾迪康医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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