本发明专利技术提供了一种食管癌相关甲基化生物标志物及应用，采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取血浆循环DNA，采用EZ DNA Methylation Kit进行亚硫酸氢盐修饰。修饰后的血浆循环DNA采用质谱法检测CASZ1、CDH13和ING2食管癌相关抑癌基因中CG位点甲基化频率为生物标志物，该生物标志物用于食管癌的筛查、预判、防治。本发明专利技术具有快速、简便、灵敏、特异以及无创的优点，且DNA甲基化可以通过外源药物逆转，因而该研究结果也具有潜在的肿瘤治疗应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于癌症预防领域，尤其涉及。
技术介绍
食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，以南部和东部非洲、东亚地区发病率最高。中 国是食管癌高发区之一，发病率比美国高20到30倍。除了众所周知的行为与膳食因素与 食管癌发生有关之外，个体遗传因素也不容忽视。近年来，随着分子生物学和对肿瘤起源机 制认识的不断深入，表观遗传异常在肿瘤发生中的作用日益受到关注。 表观遗传改变的主要形式之一是DNA甲基化，这是哺乳类动物遗传外修饰的一种 重要调控方式，也是脊椎动物DNA惟一的自然化学修饰方式。DNA甲基化主要发生在富含 CG岛的基因启动子区。启动子区的CG岛发生甲基化后可以导致基因转录受抑制，蛋白表达 量减少，相应功能下降甚至丧失。由于DNA甲基化模式还具有肿瘤特异性，即不同类型的肿 瘤可能存在不同的DNA甲基化谱，通过识别DNA异常甲基化谱并构建特异文库可作为潜在 的分子生物标志物用于食管癌的诊断。 传统的食管癌诊断方法包括X线、CT、核磁共振、胃镜检查等，但均存在敏感性低 和早期病灶难以发现等缺点。寻找快速、简便、灵敏、特异的早期诊断方法成为当前食管癌 防治工作中的一项重要任务。与传统的蛋白类生物标志物相比，DNA甲基化改变常常是细 胞癌变过程中更为早期的事件，如果能够建立合理的多指标的DNA甲基化图谱，在疾病的 早期阶段即采用分子生物学技术识别出这种特异性变化，无疑对实现食管癌"三早"将具有 极重要意义。 早在上个世纪七、八十年代，科学家们就已经发现肿瘤患者的外周血中存在一种 来源于肿瘤灶的游离DNA (cell free DNA)。近几年游离DNA在肿瘤的诊断和预后中的作用 日益受到重视，成为一个具有广阔应用前景的生物标志物。实体恶性瘤能通过细胞坏死或 凋亡释放大量的DNA进入体循环，分子大小在500bp~30kb之间。近年来的研宄表明，人外 周血游离DNA的量和质的改变与疾病发生发展关系密切，有希望成为疾病诊断、疗效评估 及预后监测的一种重要分子标志物。游离DNA的遗传特征与对应的肿瘤组织高度一致，如 存在相似的基因突变、微卫星不稳定性和杂合性缺失，并且具有一致的表观遗传改变特征。 在循环DNA研宄中的一个重要发现是肿瘤患者的血浆/清中可同时检测到循环DNA的异常 甲基化，而且外周血循环DNA的甲基化模式与癌组织一致，这一发现为无创性DNA甲基化谱 分析提供了可能。 由于抑癌基因异常甲基化是肿瘤发生过程的早期事件，识别并构建甲基化谱文库 对于食管癌早期诊断和预后具有重要的应用价值，尤其是识别外周血中肿瘤特异性DNA甲 基化谱更是为寻找无创性食管癌诊断标志物提供了线索。由于DNA甲基化可以通过外源药 物逆转，因而该研宄结果也具有潜在的肿瘤治疗应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，旨在解决现有 食管癌诊断方法包括X线、CT、核磁共振、胃镜检查等存在敏感性低和早期病灶难以发现等 问题。 本专利技术是这样实现的，一种食管癌相关甲基化生物标志物，通过在CASZ1、⑶H13 和ING2食管癌相关抑癌基因中检测到的特定CG位点甲基化频率为生物标志物。 该生物标志物获取的具体过程包括：采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外 周静脉血，分离上层血衆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取血衆循环DNA， 采用EZ DNA Methylation Kit进行亚硫酸氢盐修饰。修饰后的血衆循环DNA采用质谱法 检测相关基因CG位点的甲基化。 本专利技术进一步提供了上述食管癌相关甲基化生物标志物在筛查、预判、防治待检 者罹患食管癌方面的应用。 通过检测样品中CASZ1、⑶H13和ING2的甲基化频率可以辅助判断待检者罹患食 管癌的可能性大小，在患者发生食管癌的早期即可识别，有助于早发现、早诊断、早治疗。 相比于现有技术的缺点和不足，本专利技术具有以下有益效果： (1)本专利技术以外周血循环DNA甲基化作为生物标志物用于食管癌的早期筛查、预 判、防治，具有快速、简便、灵敏、特异以及无创的优点，具有重要的应用价值。 (2)本专利技术生物标志物中DNA甲基化可以通过外源药物逆转，因而该研宄结果也 具有潜在的肿瘤治疗应用前景。【具体实施方式】 为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于 限定本专利技术。 实施例1食管癌相关甲基化生物标志物的获取 1、血液采集 采用EDTA真空抗凝采血管采集患者空腹外周静脉血3~5ml，3, 000转/分钟离 心10分钟，小心吸取上层血浆置于离心管中，再次离心10分钟，速度5, 000转/分钟，吸取 上层血浆置于另一冻存管，用于DNA甲基化检测，待测样本可置-80°C冷冻保存。 2、DNA 提取 米用 QIAamp Circulating Nucleic Acid kit 提取血衆 DNA。试剂盒由 Mini Columns， Tube Extenders， Elution Tubes， VacConnectors， Collection Tubes， Buffer ACL，Buffer ACB，Buffer ACW1，Buffer ACW2, Buffer AVE，Carrier RNA 以及蛋白酶 K 组 成。 3、DNA 修饰 采用美国EZ DNAMethylation Kit进行亚硫酸氢盐修饰。试剂盒中包括 M-Dilution Buffer，CT Conversion Reagent，M-Binding Buffer，Zymo-SpinTMIC Column， M-Wash Buffer，M-Wash Buffe，M-Elution Buffer，Collection Tubes。修饰后的 DNA 样 本放入-20 °C冰箱备用。 4、甲基化检测 设计PCR引物，如下表1所示： 表1血液样本甲基化检测的引物序列【主权项】1. 一种食管癌相关甲基化生物标志物，其特征在于，通过在CASZ1、⑶H13和ING2食管 癌相关抑癌基因中检测到的特定CG位点甲基化频率为生物标志物。2. 权利要求1所述的食管癌相关甲基化生物标志物在筛查、预判、防治待检者罹患食 管癌方面的应用。【专利摘要】本专利技术提供了，采用EDTA真空抗凝采血管采集待测者的外周静脉血，分离上层血浆，采用QIAamp Circulating Nucleic Acid kit提取血浆循环DNA，采用EZ DNA Methylation Kit进行亚硫酸氢盐修饰。修饰后的血浆循环DNA采用质谱法检测CASZ1、CDH13和ING2食管癌相关抑癌基因中CG位点甲基化频率为生物标志物，该生物标志物用于食管癌的筛查、预判、防治。本专利技术具有快速、简便、灵敏、特异以及无创的优点，且DNA甲基化可以通过外源药物逆转，因而该研究结果也具有潜在的肿瘤治疗应用前景。【IPC分类】C12Q1-68【公开号】CN104745700【申请号】CN201510142243【专利技术人】王建明, 彭献镇, 薛恒川, 王建平, 沈烨 【申请人】南京医科大学【公开日】2015年7月1日【申请日】2015年3月27日本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种食管癌相关甲基化生物标志物，其特征在于，通过在CASZ1、CDH13和ING2食管癌相关抑癌基因中检测到的特定CG位点甲基化频率为生物标志物。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王建明，彭献镇，薛恒川，王建平，沈烨，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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