SFRP5基因启动子甲基化检测的引物和检测方法技术

本发明专利技术公开了SFRP5基因启动子区多CG位点甲基化检测的引物和方法包括：(1)扩增SFRP5基因启动子区的正、反向兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2；(2)上述引物扩增的目标序列包括至少6个CG位点；(3)针对石蜡切片DNA片段化严重，而亚硫酸氢盐修饰饱和状态下仍呈现有效模板浓度低的问题，将Touch‑down PCR扩增和Sanger测序相结合，可显著提高检测灵敏度。本发明专利技术具有特异性高，准确度高以及低污染风险等优点，可检测肿瘤患者手术石蜡切片SFRP5基因启动子区多个CG位点甲基化，结果可指导医生进行相关疾病的预后评估。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生命科学和生物
，是一种检测SFRP5基因启动子甲基化状态的引物和检测方法。
技术介绍
Wnt信号传导通路参与了胚胎发育及成体组织细胞增殖、分化及凋亡等调控过程。Wnt通路的过度激活常引起细胞过度增殖及凋亡减弱，进而诱导肿瘤的发生。Wnt拮抗因子分泌型Frizzled相关蛋白(secreted Frizzled-related protein，SFRP)家族含有5个成员，SFRP1～SFRP5。这些蛋白一个共同特征为拥有一个富含半胱氨酸的区域(cysteine-rich domain，CRD)，该区域与Wnt受体Frizzled蛋白的CRD具有高度同源性。因此，SFRP蛋白家族可与Frizzled蛋白受体竞争Wnt配体，从而对Wnt通路发挥负调控作用。分泌型卷曲相关蛋白5(SFRP5)作为较为重要的SFRPs成员之一，其启动子甲基化导致的沉默与恶性肿瘤的发生和发展密切相关，故SFRP5通常被认为是一种抑癌基因，SFRP5被观察到促进癌细胞的生长、侵袭，并抑制其凋亡。结构上与Wnt信号通路的特异性受体卷曲蛋白(Fz)受体极为相似，具有同源的配体抑制区，通过竞争性抑制Fz受体从而抑制Wnt的活动。有研究显示在白血病细胞中存在SFRP5基因启动子区域甲基化，导致SFRP5蛋白表达缺失或下调，但这种SFRP5基因甲基化在白血病发生发展中的作用尚不明确。SFRP5的异常表达往往致使疾病的发生。过度表达可导致心室肌细胞凋亡、肢带肌萎缩症2A、风湿性关节炎和骨关节炎等。SFRP5还与脂肪生成、肥胖症及能量与葡萄糖平衡有关。在恶性肿瘤中SFRP5及其家族其他成员启动子区异常甲基化导致的表达下调，表明其功能减弱或丧失使Wnt途径异常激活导致肿瘤发生，反映了它们可能的抑癌基因特性。研究者在对100例髓性血浆肿瘤患者SFRPs基因进行甲基化状态检测时发现，有29％的SFRPl、19％的SFRP2和9％的SFRP5发生了甲基化改变。研究者对76例初治骨髓瘤患者的SFRPs基因进行甲基化检测，发现有35.5％的SFRPl、52.6％的SFI冲2、1.3％的SFRP4和6.9％的SFRP5存在高甲基化，提示SFRP5的高甲基化可能与疾病的进展有关。目前对于SFRP5启动子甲基化检测的常规方法有：甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐焦磷酸测序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)，甲基化特异性PCR(MS-PCR)等。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否存在甲基化，该法实用且普遍，但假阳性较高，稳定性较差；亚硫酸氢盐焦磷酸测序因其操作繁琐，因此不适合大批量检测；MS-HRM是通过将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，同时该法只能分析检测片段整体甲基化状态，而不能明确每个CG位点的甲基化状态；MS-PCR是基于PCR开发的技术，主要是在检测中加入了TaqMan探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但其对于多个甲基化位点的检测，也只能做到整体化分析，同时探针成本较高，因此该法较适用于少数位点大量样本检测。本专利技术采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法SFRP5启动子甲基化检测，针对石蜡切片DNA片段化严重，在造成亚硫酸氢盐处理饱和的情况下，仍出现的有效模板浓度很低的情况，Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因突变的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。由于DNA序列在经亚硫酸盐处理后，其部分C碱基会转变为T，导致序列区域内CG含量和TM值发生较大程度的变异，进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序列。因此，本专利技术中PCR采用的扩增引物以及测序引物均为自行设计，其中测序引物使用兼并碱基，从而使得阴性、阳性都可在同一体系扩增。同时，扩增引物的使用比例经过多次优化实验，相对于其它文献和软件设计的引物具备了更加理想的扩增效率。因此，本专利技术的检测方法具备了检测出率高，检测稳定性好，准确度高以及低污染风险等优势。检测结果将有助于预见相关肿瘤疾病的早期，同时具有潜在的指导临床医生个体化治疗的作用。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是：设计用于检测SFRP5基因启动子甲基化的引物，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’-AGGGAGGTAGGGAGTTTTGGGGAGA-3’；SEQ NO 2：5’-AATCGCCCAAATAAATAACAACCTACGCTAC-3’；所述SEQ NO 1和SEQ NO 2也同为测序引物。本专利技术提供的另一个技术方案是：用于检测SFRP5基因启动子甲基化的方法，包括：(1)提取样本中的DNA；(2)将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2扩增SFRP5基因片段，获得PCR扩增产物；(4)对步骤(3)中获得的产物测序；(5)根据步骤(4)的测序结果，得到序列CG位点的甲基化结果；其中，PCR扩增反应条件为：第一阶段，92-97℃预变性5-15min；第二阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度62-66℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环12-18次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度53-57℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24-34次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。所述的测序为Sanger测序，测序引物为：SEQ NO 1：5’-AGGGAGGTAGGGAGTTTTGGGGAGA-3’；SEQ NO 2：5’-AATCGCCCAAATAAATAACAACCTACGCTAC-3’；该方法检测的样本为石蜡切片样本、全血样本、新鲜组织样本或细胞系样本。更进一步地，本专利技术提供一种用于检测SFRP5基因启动子甲基化的试剂盒的技术方案，包括亚硫酸盐修饰、PCR扩增试剂以及Sanger测序试剂、阳性对照品、阴性对照品，其中：(1)亚硫酸盐处理试剂包括：Bisulfite Mix、RNase free water、DNA Protect Buffer；(2)PCR扩增试剂：10*PCR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq酶、10uM扩增引物(SEQ NO1、SEQ NO 2)以及灭菌水；(3)酶纯化试剂：EXOI、CIP；(4)测序试剂：Bigdye Terminator V3.1、无水乙醇、EDTA、及测序引物(SEQ NO 1、SEQ NO 2)。其中，阳性对照本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于检测SFRP5基因启动子甲基化的引物，其特征在于，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’‑AGGGAGGTAGGGAGTTTTGGGGAGA‑3’；SEQ NO 2：5’‑AATCGCCCAAATAAATAACAACCTACGCTAC‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于检测SFRP5基因启动子甲基化的引物，其特征在于，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：SEQ NO 1：5’-AGGGAGGTAGGGAGTTTTGGGGAGA-3’；SEQ NO 2：5’-AATCGCCCAAATAAATAACAACCTACGCTAC-3’。2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，扩增引物同为测序引物，所述测序引物的序列为：SEQ NO 1：5’-AGGGAGGTAGGGAGTTTTGGGGAGA-3’；SEQ NO 2：5’-AATCGCCCAAATAAATAACAACCTACGCTAC-3’。3.一种用于检测SFRP5基因启动子甲基化的方法，包括：(1)提取样本中的DNA；(2)将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2扩增SFRP5基因片段，获得PCR扩增产物；(4)对步骤(3)中获得的产物测序；(5)根据步骤(4)的测序结果，得到序列CG位点的甲基化结果；其所述引物序列为：SEQ NO 1：5’-AGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：林有升，单战，王淑一，
申请(专利权)人：合肥艾迪康临床检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34